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《分子植物育种》印刷版, 2013 年, 第 11 卷, 第 15 篇 doi: 10.3969/mpb.011.000578
收稿日期: 2013年01月18日 接受日期: 2013年03月15日 发表日期: 2013年06月05日
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利用NCBI、CODEHOPE、Primer Premier5.0等数据库和生物软件设计兼并引物,以矮牵牛花柱cDNA为模板,利用RT-PCR扩增到1条长为417 bp的序列,在GenBank中比对发现,该序列与SX基因相似性最高。然后以SX序列为模板设计特异性引物,RT-PCR扩增到1条全长为747 bp的目的片段,测序结果分析表明,该基因核苷酸序列开放阅读框全长660 bp,编码220个氨基酸,其中包括有22个氨基酸的跨质膜信号肽区,和5个保守区(C1-C5)以及2个高变区(Hva, Hvb),据前人研究所知,该基因具有S-核酸酶功能。同时,从番茄DNA中克隆到一长为717 bp的花粉特异性启动子LAT52。为了使SX基因能在花粉中发挥其S-核酸酶功能,去掉22个氨基酸跨质膜信号肽(命名为sx)之后,与番茄花粉特异性启动子LAT52嵌合构建植物表达载体并转化拟南芥。TTC染色结果表明,LAT52能特异性的在花粉中调控sx基因的表达,使花粉活力很低甚至没有活力,从而使转基因植株不育。
自交不亲和性(Self-incompatibility, 简称SI)也叫自交不育性,是植物在其长期进化过程中形成的有利于异花授粉的一种生殖隔离(吴华清等, 2005),是花粉与雌蕊综合作用的结果(Zhang et al., 2009),在植物遗传改良和作物杂种优势利用上具有重要价值(李凤霞等, 2009)。根据花粉SI表型的遗传控制方式可将植物自交不亲和性分为配子体自交不亲和性(gametophytic self-incompatibility, GSI)和孢子体自交不亲和性(sporophytic self-incompatibility, SSI) (胡彬等, 2012)。对于配子体自交不亲和性植物的研究最多的是茄科、蔷薇科、玄参科、罂粟科和十字花科(Kubo et al., 2010, Takayama and Isogai, 2005)。这类植物的自交不亲和性是由雌蕊自交不亲和因子和花粉自交不亲和因子相互作用的结果(杨谷良等, 2005),目前普遍认为雌雄配子体特异性识别是由花柱中的S-核酸酶(S-RNase)基因以及花粉决定因子SLF (S-Locus F-box)蛋白决定的(张一婧和薛勇彪, 2007)。茄科植物的花柱决定因子已经被鉴定为S-核酸酶,这类S-RNase基因呈现S-单倍型间的高度多态性,有着类真菌T2型核酸酶结构和核酸酶活性的糖蛋白;而花粉决定因子则被确认为一类F-box蛋白,可能作为一种泛素连接酶SCF复合体(SKP1-CUL1-F-box)的组分,参与26S蛋白酶降解途径(吴静等, 2002; Kao and Tsukamoto, 2004)。一般同一科属的植物自交不亲和机制相同,不同科属植物的自交不亲和机制不同,不同自交不亲和系统的S基因之间没有明显的同源性(Charlesworth et al., 2005)。
矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)为茄科矮牵牛属花卉,是由原产阿根廷的白花矮牵牛、胀筒矮牵牛和紫花矮牵牛等种经过复杂的相互杂交而育成的多年生草本花卉(王妍等, 2011)。由于矮牵牛早期分类比较混乱,据推测,现在栽培的矮牵牛为腋花矮牵牛(P. axillaria)和撞羽矮牵牛(P. wilavea)杂交变异而来(代色平和包满珠, 2004)。研究表明,矮牵牛的花柱决定因子S-RNase基因有22个氨基酸的信号肽,5个保守区(Conserved region) (C1-C5)以及2个高变区(Hypervariable region, 简称HV) (Hva, Hvb) (Kubo et al., 2010),其中信号肽引导S-RNase向细胞质基质分泌并在授粉过程中进入花粉管细胞;疏水区C1、C4、C5与S-RNase的结构有关;C2、C3是S-RNase的活性部位。高变区划分为HVa和HVb介于C2和C3之间,是S-糖蛋白中含亲水集团最多的部分(李凤霞等, 2009)。
本研究通过设计兼并引物、特异性引物,利用RT-PCR手段从茄科矮牵牛(Petunia hybrida)中克隆了具有S-核酸酶功能的SX基因,对其生物信息学进行分析后,去掉其信号肽部分,将其与花粉特异性启动子嵌合构建植物表达载体,获得了转基因拟南芥并对其功能进行初步分析,以期为创造新的不育系奠定基础。
1结果与分析
1.1自交不亲和性基因SX的克隆及序列分析
以矮牵牛花柱的cDNA为模板,用兼并引物SR1和SR2,PCR扩增得到一条410 bp左右的条带(图1)。测序结果比对发现该序列与SX基因(Genbank登录号: M81685.1)相似性最高,以SX1和SX2为引物,PCR扩增得一全长747 bp目的条带(图2)。测序结果BLAST比对发现,与SX氨基酸序列相似性为100%。
图1 兼并引物RT-PCR产物
注: 1~4: PCR产物; M: MarkⅠ Figure 1 RT-PCR product of degenerate primers Note: 1~4: RT-PCR product of degenerate primers; M: MarkⅠ |
图2 SX基因RT-PCR扩增产物
注: 1~6: PCR产物; M: MarkⅢ Figure 2 RT-PCR product of SX gene Note: 1~6: RT-PCR product of SX; M: MarkⅢ |
依照Kubo等(2010)对9种矮牵牛的花柱S-R- Nase氨基酸的同源性比对和结构区域分析,发现SX同样有22个氨基酸的信号肽,5个保守区(C1-C5)以及2个高变区(Hva, Hvb) (图3)。
图3 矮牵牛中10种S-RNase氨基酸序列比较
注: 信号肽区用双实线表示, 5个保守区和2个高变区用实线表示 Figure 3 Alignment of the amino acid sequences from ten S-haplotypes of Petunia Note: The signal peptide of S-RNase and the conserved regions, hyper-variable regions are indicated by double solid and solid |
1.2自交不亲和性基因sx的扩增
为了避免SX基因N端信号肽引导S-RNase向细胞质基质分泌,去掉66 bp的信号肽,重新设计引物(sx1, sx2) PCR扩增到696 bp片段,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行双酶切鉴定(图4)并送测序,为了与原基因区别,将其命名为SX。
图4 pGM-SX质粒鉴定
注: 1: pGM-SX质粒对照; 2~5: 质粒酶切; M: MarkⅢ Figure 4 pGM-SX plasmid detection Note: 1: pGM-SX plasmid; 2~5: pGM-SX is digested by XmaⅠ/SacⅠ; M: MarkⅢ |
1.3番茄花粉特异性启动子LAT52的克隆
以番茄总DNA为模板进行PCR扩增,获得片段大小为717 bp (图5),与GenBank登录的LAT52序列相比,核苷酸相似性为99.44%。
![]() 图5 pGM-LAT52质粒鉴定 注: 1: pGM-LAT52质粒对照; 2~5: 质粒酶切; M: MarkⅢ Figure 5 pGM-LAT52 plasmid detection Note: 1: pGM-LAT52 plasmid; 2~5: pGM-LAT52 is digested by HindⅢ/XmaⅠ; M: MarkⅢ |
1.4植物表达载体PBI121-LAT52-SX的构建
用HindⅢ/XmaⅠ双酶切重组质粒pBI121-LA-T52,得到预期大小717 bp的片段(图6),用HindⅢ/SacⅠ双酶切鉴定重组质粒pBI121-LAT52-SX,得到预期大小1 413 bp的片段(图7),证明植物表达载体pBI121-LAT52-SX构建成功(图8)。
图6 pBI121-LAT52重组质粒酶切鉴定
注: 1: pBI121-LAT52重组质粒对照; 2~5: 质粒双酶切鉴定结果; M: MarkⅢ Figure 6 Identification of recombined plasmid pBI121-LAT52 by restriction enzyme Note: 1: pBI121-LAT52-SX plasmid; 2~5: Identification of recombined plasmid by HindⅢ/XmaⅠ; M: MarkⅢ |
图7 植物载体pBI121-LAT52-SX酶切鉴定
注: 1: pBI121-LAT52-SX重组质粒对照; 2~6: 质粒双酶切鉴定结果; M: MarkⅢ Figure 7 Identification of recombined plasmid by restriction enzyme Note: 1: pBI-121-LAT52-SX plasmid; 2~6: Identification of recombined plasmid by double restriction enzyme; M: MarkⅢ |
图8 pBI121-LAT52-SX载体模式图
Figure 8 The vector diagram of pBI121-LAT52-SX |
1.5转基因拟南芥纯合子筛选及目的基因检测
将pBI121-LAT52-SX的植物表达载体用农杆菌介导的滴花法侵染拟南芥花序(许红梅等, 2010),收T0代种子,在含有Kan 50 mg/L的培养基上筛选抗性苗,将这些Kan-抗性苗移栽至花盆。并将移栽出来的拟南芥植株提取DNA,进行PCR检测,结果表明转基因株系中均能扩增出目的片段,野生型拟南芥中未能扩增出目的片段的条带,说明目的基因完全插入拟南芥基因组DNA (图9; 图10)。
图9 转基因植株启动子LAT52 PCR检测
注: 1: pBI121-LAT52-SX质粒对照; 2~9: 转基因拟南芥; 10: 野生型拟南芥; M: MarkⅢ Figure 9 Promoter LAT52 PCR identification of transgenic plants Note: 1: Plasmid control; 2~9: The transgenic plants; 10: WT; M: MarkⅢ |
图10 转基因植株基因SX PCR检测
注: 1: pBI121-LAT52-SX质粒对照; 2~9: 转基因拟南芥; 10: 野生型拟南芥; M: MarkⅢ Figure 10 Gene SX PCR identification of transgenic plants Note: 1: Plasmid control; 2~9: The transgenic plants; 10: WT; M: MarkⅢ |
1.6转基因植株的育性检测
在50和100倍的光学显微镜下分别观察生长50 d后的拟南芥花瓣、雄蕊的发育情况,发现获得的转基因植株和野生型植株相比,转化个体在高度,大小和生活周期上均无明显差异。用TTC (2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride)法染色(孙春丽和潘延云, 2008),观察发现转基因植株大多数呈现无色,少部分为淡红色;而野生型植株花粉多数呈红色、少部分为深红色(图11),由此证明转基因花粉的活力非常低下甚至没有活力,说明sx基因能被花粉特异性启动子正确调控在花粉中发挥其S-核酸酶作用,使花粉活力很低甚至没有活力,从而引起转基因植株的不育。
图11 转基因与野生型拟南芥花粉活力检测
Figure 11 Identification of pollen viability between transgenic plants and type Arabidopsis |
2讨论
许多显花植物通过自交不亲和机制防止近亲繁殖和物种退化,因此SI为物种的生存、发展以及种群的相对独立性提供了有力的保障(Kao and Tsukamoto, 2004)。GSI中植物的自交不亲和性是由花柱S-RNase和花粉F-Box蛋白的相互作用而导致的(杨谷良等, 2005),随着研究的深入,人们发现配子体自交不亲和远比人们想象的复杂,整个反应过程还有许多因子参与(张一婧和薛勇彪, 2007)。但是花柱 S-决定子已确定为S-核酸酶,并且大量的S-核酸酶基因已经被克隆出来(李疆等, 2002),茄科S-RNase的结构特点是具有5个保守(C1, C2, C3, C4和C5)、两个高变区(Hva, Hvb),且在N-末端有一个22个氨基酸的信号肽,可引导S-RNase向细胞质基质分泌,并在授粉过程中进入花粉管细胞(Kubo et al., 2010)。本研究中克隆的SX基因是从自交亲和的园艺品种矮牵牛(Petunia hybrida) F1代中获得的,将自交亲和的矮牵牛(Petunia hybrida) F1代植株与自交不亲和的矮牵牛(Petunia inflata)进行种间杂交试验证实,SX为一具有S-核酸酶功能的蛋白(Ai et al., 1992)。
自交不亲和性在作物遗传改良和杂种优势利用上有重要价值(牛俊海等, 2006),目前主要是利用雄配子体发育过程中特异性启动子和外源细胞毒素基因、B-1,3-葡聚糖酶基因以及查尔酮合成酶反义RNA等构成嵌合基因转化植物,启动子的特异性使得外源基因选择性的表达,破坏花粉发育过程中的某些器官或组织中的细胞(王永飞等, 2002),使花粉不能正常形成,从而产生不育花粉达到产生雄性不育的目的(杨泽良等, 2005)。克隆及分析花药和花粉发育过程中重要基因的功能已成为植物生长发育研究的热点(陈睿等, 2011),目前对在花药和花粉中表达的基因结构和功能的了解主要限制在花药和花粉发育的特定阶段,花粉特异性基因的转录是在小饱子有丝分裂时出现,随着花粉的成熟不断积累,到花粉成熟时其含量达到最高(汪迎春等, 2000, 生物工程进展, 20(2): 52-54)。研究表明LAT52为番茄中的花粉特异性基因,在花粉营养细胞中特异性的表达,其mRNA在花粉有丝分裂后出现,在花开期达到最高(刘乐承等, 2006,长江大学学报, 3(3): 174-178)。LAT52基因mRNA的合成,一部分与花粉的成熟有关,另一些在花粉萌发以及花粉管伸长时翻译(Twell et al., 1989)。
只要有合适的、高效表达的启动子,不论双子叶还是单子叶作物,都能定向地创造出雄性不育系(王长海等, 1999),本研究从番茄基因组中克隆到花粉特异性启动子LAT52、从矮牵牛中克隆到S-RNase基因,为了避免S-RNase在花柱细胞质基质分泌,能在花粉中特异表达,去掉N端22氨基酸信号肽,与LAT52启动子嵌合构建植物表达载体并转化拟南芥,结果表明,LAT52能使sx基因在花粉中高效表达,使花粉活力很低甚至失去活力,最终导致转基因植株不育。该研究给植物分子杂交育种提供了1条基因资源,也为转基因作物的应用奠定了基础。
3材料与方法
3.1材料
矮牵牛、番茄试管苗购自石河子园林处,大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、植物表达载体pBI121,由石河子大学生物技术中心保存;凝胶回收试剂盒购自Promega公司;限制性内切酶、反转录试剂盒购自Takara公司;植物总RNA提取试剂盒、克隆载体pGM-T、Taq DNA Polymerase、10×Taq Reaction Buffer、dNTP、T4 DNA连接酶购自TIANGEN公司;其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。
3.2方法
3.2.1自交不亲和性基因的克隆
根据矮牵牛花柱S-RNase同源基因保守区进行CLASTALX比对,利用Blockmaker、CODEHOPE软件设计兼并引物SR1、SR2 (表1),用TIANGEN公司植物RNA提取试剂盒(RNAprep pure plant kit)提取矮牵牛花柱总RNA,反转录cDNA,以cDNA为模板,进行PCR扩增并测序。PCR反应程序为:95℃预变性4 min;95℃变性30 s,58℃复性30 s,72℃延伸30 s,30循环;72℃延伸7 min;4℃保存。利用Primer5.0设计特异性引物SX1、SX2 (表1),以矮牵牛花柱cDNA为模板进行PCR扩增并测序。去掉SX序列N端66 bp的信号肽重新设计引物sx1、sx2 (表1),PCR扩增。PCR反应程序为:95℃预变性4 min;95℃变性30 s,58℃复性45 s,72℃延伸45 s,30循环;72℃延伸7 min;4℃保存。PCR产物经浓度为1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离后,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Promega)回收目的条带。将回收的目的片段与克隆载体pGM-T Easy Vocte (TIANGEN)连接,将连接产物转化DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆并提取质粒经XmaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定正确后进行测序。
表1 研究中所用的引物序列
Table 1 Sequences of oligonucleotide primers used in this study |
3.2.2番茄花粉特异性启动子LAT52的克隆
根据GenBank公布的LAT52 (GenBank序列登录号: X15855.1)序列,利用Primer5.0设计特异性引物L1、L2 (表1),参照本实验室CTAB法(郭新勇等, 2012)提取番茄基因组DNA,以番茄总DNA为模板进行PCR扩增。回收目的片段,连接转化,提取质粒经HindⅢ和XmaⅠ双酶切鉴定正确后送测序。
3.2.3植物表达载体的构建
用HindⅢ和XmaⅠ双酶切阳性克隆pGM-LA- T52和植物表达载体pBI121,回收目的小片段和载体大片段。将两片段进行连接,经鉴定正确的重组质粒命名为pBI121-LAT52。用XmaⅠ和SacⅠ双酶切阳性克隆pGM-sx和重组质粒pBI121-LAT52,然后将重组子转化大肠杆菌并进行鉴定。将重组质粒用农杆菌冻融法转入根癌农杆菌GV3101中,经PCR鉴定得到阳性单克隆,侵染野生型拟南芥花序。
3.2.4拟南芥的遗传转化及PCR 检测
待野生型拟南芥开花后用滴花法浸染拟南芥。收取T0代种子,在含有kan-50 mg/L的培养基上筛选抗性苗,并移栽至花盆,用CTAB法提取生长约22 d左右的转基因植株和野生型拟南芥植株基因组DNA、以pBI121-LAT52-SX作物阳性对照,进行PCR检测。
3.2.5转基因植株的花粉活力检测
在50和100倍的光学显微镜下用解剖针剖开花瓣取下花药,将花药在载片上剖开,加1~2滴浓度为0.5% TTC染色液于载玻片上,搅匀后置于35℃恒温箱中15 min,盖上盖玻片镜检观察,检测花粉活力。
作者贡献
何黎是本研究的实验设计和实验研究的执行人,完成数据和实验结果分析和论文初稿的写作;邱红林,陈泉、闫甜甜和陈晨参与实验设计和实验结果分析;祝建波是项目的构思者及负责人,指导实验设计,数据分析,论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由兵团博士基金(2009jc01)资助。感谢实验室相关人员的帮助。
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