能源是人类社会赖以生存和发展的重要物质基础，随着世界经济和工业的现代化快速发展，传统化石能源的日益短缺愈发严重，而人类对于能源的需求却日益增加(Jain and Sharma, 2010)。由于传统化石燃料的不可再生性，经济快速发展所面临的能源短缺问题日趋严重(Ou et al., 2009)，因此，寻求和开发利用可再生新能源成为当前刻不容缓的大事。在众多可利用的新能源中，生物质能以其绿色可再生性及对环境无任何污染等优点，受到各国政府和社会的高度关注(Wang et al., 2009; 姚波和刘火安, 2010; Li et al., 2011)。由于中国人口众多，国家严禁以牺牲农业用地为代价进行生物能源的发展，因此，发展生物能源必须做到“不与人争粮，不与粮争地”的方针政策(宋永芳, 2006)。木本能源植物黄连木由于对环境的适应性比较强，可以在荒山荒地种植。因此，利用黄连木发展生物能源具有较大的优势和应用前景(Li et al., 2007)。

黄连木(Pistacia chinensis Bunge)，又名楷木、楷树，是一种漆树科黄连木属落叶乔木，优良的观赏、用材及产油树种。黄连木属中国北方树种，在中国广泛分布，其中以河北、河南、安徽、陕西等最多(侯新村等, 2010; 秦飞等, 2007)。黄连木用途广泛，含油量较高，果实含油率约35%左右，种仁含油率高达56%，黄连木油是优质的生物柴油原料油脂。因此，国家林业局将其确定为“十一五”期间重点发展的林业生物质能源树种，具有极高的经济利用价值(秦飞等, 2007; 侯新村等, 2007)。然而，黄连木目前多数处于原始野生状态，生产中存在着果实产量较低、病虫害严重、产量不稳定等诸多问题(宋宏伟等, 2006; 安倩等, 2011)。因此，选育丰产稳产、综合性状优良的植株类型，以便提高其产量和质量，是目前发展黄连木生物能源原料林的当务之急(吴志庄等, 2008)。

利用转基因技术对生长周期较长的林木进行遗传改良是目前研究的热点。在农杆菌介导的遗传转化中，选择合适的筛选和抑菌抗生素是一个关键问题，不同物种或外植体对于抗生素的敏感性差别较大。因此，在转化之前，有必要对外植体进行筛选和抑菌抗生素进行敏感性实验。卡那霉素和潮霉素在植物遗传转化过程中被作为筛选标记基因已被广泛应用(Bevan et al., 1983)；头孢霉素和氨苄青霉素被作为抑菌抗生素也应用于转基因技术中(程振东等, 1994)。本研究在已经建立的黄连木子叶再生体系的基础上，针对后续遗传转化过程中所用筛选和抑菌抗生素的敏感性进行研究，为将来开展黄连木遗传转化研究奠定基础。

1结果与分析
1.1卡那霉素对子叶分化诱导率的影响
对于不同浓度的卡那霉素培养基，子叶分化的诱导情况随着抗生素浓度的增加诱导效率和再生苗的质量有下降的趋势(表1)。当抗生素浓度小于10 mg/L时，诱导芽体的整体质量状况与对照相比差别不大；当抗生素浓度达到20 mg/L以上时，不仅芽的诱导率大幅降低，芽体的生长状况及颜色、外形等也发生较大变化，主要表现为植株弱小；当抗生素浓度达到50 mg/L时，子叶分化的诱导基本被抑制。表2方差分析结果表明，卡那霉素对于子叶分化的诱导影响达到显著水平，可以作为有效的抗生素筛选剂。

 

表1 不同浓度的卡那霉素对子叶分化诱导的影响 Table 1 Effects of kanamycin at different concentrations on the differentiation of cotyledon

表2 卡那霉素对子叶分化诱导的方差分析 Table 2 Variance analysis of kanamycin's effect on the differentiation of cotyledon

1.2潮霉素对子叶分化诱导率的影响
从表3可以发现，子叶外植体对于潮霉素较敏感。随着潮霉素浓度的增加，子叶分化诱导率呈现明显的下降趋势，当浓度为2 mg/L时，子叶分化诱导率与对照相比已经较为明显；当浓度为6 mg/L时，子叶分化诱导率迅速降至23.81%；当浓度达到10 mg/L时，子叶分化基本被抑制。并且，随着抗生素浓度的增加，诱导产生的分化芽质量也越来越差，长势变弱，即使诱导出幼芽，培养一段时间也停止生长，甚至死亡。可见，潮霉素对于子叶分化的诱导有强烈的抑制作用。方差分析结果显示，潮霉素对于子叶分化诱导的影响达显著水平(表4)。

表3 不同浓度的潮霉素对子叶分化诱导的影响 Table 3 Effects of hygromycin at different concentrations on the differentiation of cotyledon

表4 潮霉素对子叶分化诱导的方差分析 Table 4 Variance analysis of hygromycin’s effect on the differentiation of cotyledon

1.3头孢霉素对子叶分化诱导率的影响
头孢霉素对于子叶分化诱导的影响与潮霉素相比相对较小。表5表明，头孢霉素要达到较高的浓度才能对其分化诱导产生一定的抑制作用，且随着浓度的增加，其诱导效率也逐渐下降。方差分析表明，各处理浓度之间对于分化诱导的表现达到差异显著性(表6)。当头孢霉素浓度达到200 mg/L时，其分化诱导效率仍可以达到66.67%；当抗生素浓度达到400 mg/L以上时，芽体质量开始发生变化，叶片颜色褪绿，少数芽表现出轻微玻璃化症状。

表5 不同浓度的头孢霉素对子叶分化诱导的影响 Table 5 Effects of cefotaxime at different concentrations on the differentiation of cotyledon

表6 头孢霉素对子叶分化诱导的方差分析 Table 6 Variance analysis of cefotaxime's effect on the differentiation of cotyledon

1.4氨苄青霉素对子叶分化诱导率的影响
与头孢霉素一样，黄连木子叶对于氨苄青霉素的敏感性也相对较弱，只有达到较高的浓度才能对其诱导分化产生一定的抑制作用。从表7方差分析可以发现，在含不同浓度氨苄青霉素的培养基上，子叶诱导芽的频率达到差异显著水平。表8结果显示，当氨苄青霉素的浓度为400 mg/L时，仍有近一半的子叶可以诱导分化出芽，当浓度达到500 mg/L时，其分化诱导率依旧可以达到38.10%，表明子叶对于氨苄青霉素的反应较为迟钝，不适宜作为遗传转化过程中有效的抗生素筛选剂。

表7 不同浓度的氨苄青霉素对子叶分化诱导的影响 Table 7 Effects of ampicillin at different concentrations on the differentiation of cotyledon

 

表8 氨苄青霉素对子叶分化诱导的方差分析 Table 8 Variance analysis of ampicillin's effect on the differentiation of cotyledon

2讨论
卡那霉素、潮霉素、头孢霉素和氨苄青霉素是广泛应用于农杆菌介导植物遗传转化过程中的筛选和抑菌抗生素，但这些抗生素对不同植物的不同组织的分化作用影响不同。因此，针对新的受体植物材料，很有必要筛选出适合的抗生素种类，找出并确定筛选效果好但对受体材料分化影响最小的适宜浓度(吴关庭等, 2005)。

卡那霉素和潮霉素是植物遗传转化中常用的抗生素标记基因。研究结果表明，针对黄连木子叶外植体，虽然潮霉素与卡那霉素对其子叶的分化均能产生较好的抑制作用。但是，相对潮霉素而言，卡那霉素对于外植体的伤害作用较小；而且从经济方面来讲，市场价格也较潮霉素便宜。因此，卡那霉素更适合作为筛选黄连木转基因植株的抗生素。方差分析表明，卡那霉素对于子叶分化诱导的抑制作用均达到显著差异水平。尽管如此，筛选剂浓度的大小极为重要。研究表明，较低浓度的选择压可以获得更多的转化植株，但同时也面临着更多的非转化植株得以逃脱(Ishida et al., 1996; 王萍等, 2003)。本研究认为，卡那霉素的浓度为50 mg/L时，对于黄连木子叶的筛选是比较合适的。这与其它物种一般使用浓度为15 mg/L或者100 mg/L存在一定的差异，这可能与不同物种对于卡那霉素的敏感性不同相关(朱路英等, 2004; 郭丽羡等, 2012)。

头孢霉素和氨苄青霉素是农杆菌介导植物遗传转化中常用的两种抑菌抗生素。本研究结果表明，随着抑菌抗生素浓度的增加，两种抑菌抗生素对子叶的诱导分化均产生了重要的影响作用。当浓度在300 mg/L以下时，两种抑菌抗生素对子叶诱导分化的影响差别不大，均不影响黄连木子叶的分化诱导。当头孢霉素浓度大于300 mg/L时对于子叶的分化诱导有一定的抑制作用。因此，头孢霉素的最佳浓度为200~300 mg/L。这与吴洁等(2005)研究结果基本一致。 本研究结果将为黄连木以子叶作为外植体进行遗传转化研究提供相关参考。但是，由于不同品种、不同外植体对抗生素的敏感性存在一定的差异，并且同一抗生素对不同类型的农杆菌菌种的抑制效果也可能不同。因此，在针对不同的外植体进行遗传转化之前，还需要对其做进一步研究。

3材料与方法
3.1植物材料
黄连木(Pistacia chinensis Bunge)成熟干种子，采摘于合肥科学岛，由国家林业局能源林研究中心保存。

3.2试剂与培养基
四种抗生素卡那霉素、潮霉素、头孢霉素、氨苄青霉素分别购自于上海生工和Amresco公司，成熟种子萌发培养基为1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂8.0 g/L；子叶分化诱导培养基为1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L+PVP 2.0 mg/L+蔗糖30.0 g/L+琼脂8.0 g/L，pH值均调至5.8~6.0，高温高压灭菌。

3.3实验方法
黄连木种子剥去外壳，用无菌水冲洗2次，于75%无水乙醇和20%次氯酸钠溶液分别消毒1 min和10 min，无菌水冲洗4~5次。然后将无菌种子接种在种子萌发培养基上，置于培养室25℃光照培养，15~20天左右即获得所需无菌苗。

取培养好的无菌幼苗，在其子叶部位上下各约0.5 cm处进行横切一刀，然后沿其胚轴纵切为两半，接种在含有不同种类和浓度的抗生素培养基上进行培养生长。抗生素的种类和浓度分别为：卡那霉素0、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和50 mg/L；潮霉素0、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L、8 mg/L、10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和50 mg/L；头孢霉素与氨苄青霉素均为0、100 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L和500 mg/L，每个处理重复3次，置于无菌培养室25℃光照培养，定期观察抗生素对子叶诱导芽的影响。

3.4数据分析
实验数据均采用SPSS18.0数据处理软件进行分析处理。

作者贡献
侯金艳、李明浩和吴丽芳是本研究的实验设计和实验研究的执行人；李明浩完成数据分析；毛颖基、杨鸣雷参与实验设计与分析；吴丽芳是项目的构思者，指导实验设计；侯金艳是本研究的主要执行人；石珏、黄胜威参与论文的写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由中国科学院知识创新工程重要方向性项目(KJCX2-YW-N47)和国家自然科学基金(11075178)共同资助。

参考文献
An Q., Zhang P.P., Li M.H., Chen Y.H., and Wu L.F., 2011, The biological effect of Pistacia chinensis bunge by ⁶⁰Coγ-ray irradiation, Hejishu (Nuclear Techniques), 34(7): 522-528 (安倩, 张萍萍, 李明浩, 陈于和, 吴丽芳, 2011, 60Coγ射线辐照黄连木的生物学效应, 核技术, 34(7): 522-528)

Bevan M.V., Flavell R.B., and Chilton M.D., 1983, A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation, Nature, 304: 184-187

Cheng Z.D., Wei Z.M., and Xu Z.H., 1994, Transformation of Brassica napus using Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants, Zhiwu Xuebao (Acta Botanica Sinica), 36(9): 657-663 (程振东, 卫志明, 许智宏, 1994, 根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生, 植物学报, 36(9): 657-663)

Guo L.X., Hu X.Q., Wu H.N., Wang X.L., Zhao Y.H., and Liu G.R., 2012, The application of Kanamycin in the genetic transformation of wheat immature, Mailei Zuowu Xuebao (Journal of Triticeae Crops), 32(4): 628-632 (郭丽羡, 胡晓晴, 武海娜, 王小龙, 赵艳红, 刘桂茹, 2012, 卡那霉素在小麦愈伤组织遗传转化中的应用, 麦类作物学报, 32(4): 628-632)

Hou X.C., Mou H.X., Yang S.C., Xing Y.Z., and Jing J., 2007, Research progress in woody energy plant, Anhui Nongye Kexue (Journal of Anhui Agricultural Sciences), 35(12): 3524-3525, 3534 (侯新村, 牟洪香, 杨士春, 邢艳贞, 靖静, 2007, 木本能源植物黄连木研究进展, 安徽农业科学, 35(12): 3524-3525, 3534)

Hou X.C., Zuo H.T., and Mou H.X., 2010, Geographical distribution of energy plant Pistacia chinensis bunge in China, Shengtai Huanjing Xuebao (Ecology and Environmental Sc- iences), 19(5): 1160-1164 (侯新村, 左海涛, 牟红香, 2010, 能源植物黄连木在我国的地理分布规律, 生态环境学报, 19(5): 1160-1164)

Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., and Kumashiro T., 1996, High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens, Nature Biotechnol., 14: 745-750

Jain S., and Sharma M.P., 2010, Prospects of biodiesel from Jatropha in India: a review, Renew. Sustain. Energy Rev., 14(2): 763-771

Li H.L., Zhang Z.X., Lin S.Z., and Li X.X., 2007, Research advances in the study of Pistacia chinensis bunge, a superior tree species for biomass energy, Forest Studies in China, 9(2): 164-168

Li M.H., Hou J.Y., An Q., Zhang P.P., Tang M.L., and Wu L.F., 2011, Regeneration and rapid propagation from stem explants of Pistacia chinensis bunge, Advances in Biomedical Engineering, 13: 112-118

Ou X.M., Zhang X.L., Chang S.Y., and Guo Q.F., 2009, Energy consumption and GHG emissions of six biofuel pathways by LCA in (the) people's republic of China, Applied Energy, 86(S): 197-208

Qin F., Guo T.B., Liu Z.G., and Song M.H., 2007, Literature review of researches on Pistacia chinensis bunge, Jingjilin Yanjiu (Economic Forest Researches), 25(4): 90-96 (秦飞, 郭同斌, 刘忠刚, 宋明辉, 2007, 中国黄连木研究综述, 经济林研究, 25(4): 90-96)

Song H.W., Liu J.L., Lu S.H., Liu Q.S., and Mei X.X., 2006, Research on superior tree selection and breeding technology of Pistacia chinensis bunge, Shengwuzhi Huaxue Gongcheng (Biomass Chemical Engineering), (B12): 138-141 (宋宏伟, 刘俊磊, 卢绍辉, 刘启慎, 梅象信, 2006, 黄连木优树选择与良种繁育技术的研究, 生物质化学工程, (B12): 138-141)

Song Y.F., 2006, Progress of exploitation and utilization on energy plant, Shengwuzhi Huaxue Gongcheng (Biomass Chemical Engineering), 40(6): 51-53 (宋永芳, 2006, 能源植物的开发与利用进展, 生物质化学工程, 40(6): 51-53)

Wang F., Xiong X.R., and Liu C.Z., 2009, Biofuels in China: opportunities and challenges, In Vitro Cell. Dev-Pl., 45(3): 342-349

Wang P., Wang G., Wu Y., and Ji J., 2003, Effect of antibiotics on callus formation and somatic embryogenesis from immature cotyledons of soybean, Zhongguo Youliao Zuowu Xuebao (Chinese Journal of Oil Crop Sciences), 25(1): 14-17 (王萍, 王罡, 吴颖, 季静, 2003, 抗生素对大豆未成熟子叶愈伤形成和体细胞胚胎发生的影响, 中国油料作物学报, 25(1): 14-17)

Wu G.T., Hu Z.H., Lang C.X., Chen X.Y., Jin W., Wang F.L., Chen J.Q., and Xia Y.W., 2005, The effects of antibiotics on growth and differentiation of embryogenic calli of tall fescue, Henongxue Bao (Acta Agriculturae Nucleatae Sinica), 19(2): 88-91 (吴关庭, 胡张华, 郎春秀, 陈笑芸, 金卫, 王伏林, 陈锦清, 夏英武, 2005, 抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响, 核农学报, 19(2): 88-91)

Wu J., Tan W.F., Yan W.Z., and Wang D.Y., 2005, Effects of different antibiotics on genetic transformation of sweet potato, Xi’nan Nongye Xuebao (Southwest China Journal of Agricultural Sciences), 18(1): 77-79 (吴洁, 谭文芳, 阎文昭, 王大一, 2005, 不同抗生素对甘薯遗传转化的影响, 西南农业学报, 18(1): 77-79)

Wu Z.Z., Shang Z.H., Xian H.L., and Liu Q.Z., 2008, Establishment of comprehensive evaluation index system of fine types in Pistacia chinensis bunge, Jingjilin Yanjiu (Economic Forest Researches), 26(4): 22-25 (吴志庄, 尚忠海, 鲜宏利, 刘巧哲, 2008, 黄连木优良类型综合评价指标体系的构建, 经济林研究, 26(4): 22-25)

Yao B., and Liu H.A., 2010, Effect of Sapium sebiferum (L.) roxb. in the production of Bio-diesel, Hunan Nongye Kexue (Hunan Agricultural Sciences), (5): 106-109, 112 (姚波, 刘火安, 2010, 能源植物乌桕在生物柴油生产中作用的研究进展, 湖南农业科学, (5): 106-109, 112)

Zhu L.Y., Liu L., and Zhang Z.X., 2004, Transformation of lettuce using Agrobacterium Tumefaciens, Yingyong Yu Huanjing Shengwu Xuebao (Chinese Journal of Applied and Environmental Biology), 10(1): 39-42 (朱路英, 刘玲, 张振贤, 2004, 根癌农杆菌介导的高赖氨酸蛋白基因转化叶用莴苣的研究, 应用与环境生物学报, 10(1): 39-42)