银杏(Ginkgo biloba L.)素有“活化石”之称，为银杏科银杏属植物，是第四纪冰川之后在中国保存下来的最古老的孑遗植物。银杏分布广泛，中国30个省(自治区、直辖市)均有其分布，银杏集药、膳、材、观赏及科研价值于一体，近年来得到国内外学者的高度重视。银杏经过漫长的进化史，在天然杂交和人工选择过程中，种子和叶片发生了明显的形态变异(邢世岩, 2004, 中国环境科学出版社, pp.501-509)。叶籽银杏是银杏品种中一个非常特殊的类型，在银杏起源和演化方面具有重要的研究意义(彭日三, 1995, 甘肃林业科技, (1): 58-59)。目前，关于叶籽银杏多是形态解剖学及细胞学上的研究，少有分子生物学方面的研究(李保进和邢世岩, 2007; 韩晨静等, 2011; 黄岩和邢世岩, 2012; 王京梅等, 2009; 李际红等, 2011)，且表观遗传学方面的研究更少。叶籽银杏作为银杏中的特异种质其变异机制有多种学说如环境诱变说、返祖学说、嵌合体学说等，但是至今仍无定论(李士美等, 2007)。因此，研究叶籽银杏的DNA甲基化成为解决其变异机制的重要方法。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，Holliday (1990)对表观遗传学作了较为具体的界定，即生物在不改变基因组序列的前提下通过DNA和组蛋白修饰来调控基因表达。DNA胞嘧啶甲基化是原核生物和真核生物中一种常见的转录后DNA修饰现象，即在DNA甲基转移酶催化下，利用S-腺苷基甲硫氨酸提供的甲基，将胞嘧啶的第5位碳原子甲基化，从而使胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶的化学修饰过程。它与许多重要的生物学过程有关，如基因表达(Akimoto et al., 2007)、细胞分化(Koukalova et al., 2005)、基因组印记(Platonov and Isaev, 2006)、性别表达(Janoušek et al., 1996)、生殖细胞发育(Sasaki and Matsui, 2008)等。甲基化也是DNA多态性的一种来源，属于孟德尔遗传(Messeguer et al., 1991)。DNA甲基化作为最早发现的基因表观遗传修饰方式之一，存在于所有植物中，且不同的植物或同种植物的不同组织、不同时期甲基化水平差异较大(李海林等, 2011; 李际红等, 2011; Messeguer et al., 1991)。高等植物基因组中，DNA甲基化水平大约为20%~50%，这对植物维持正常的生长发育有重要作用(Chan et al., 2005; Zilberman et al., 2007)。DNA甲基化使某些基因的活性降低，去甲基化则诱导基因的重新活化和表达。基因表达活性与DNA胞嘧啶甲基化程度呈负相关性，相关系数为-0.739 (Tsaftaris and Kafka, 1998)。在植物进化中表观遗传能揭示其介导的基因表达与形态学改变的关系(Kalisz and Purugganan, 2004; Rapp and Wendel, 2005)。最早记载的云兰属植物Linaria vulgaris的研究表明，lcyc基因超甲基化导致其花型由左右对称变为辐射状，但与其DNA序列变化无关。较低的DNA甲基化水平，将导致拟南芥植株矮化、叶片变小、结实率下降等现象，而且其性状可以遗传给后代(Jacobsen et al., 2000)。表观遗传学作为阐明基因组功能及基因表达的关键研究领域，已成为生命科学研究领域的热点之一。

目前植物DNA甲基化的研究方法很多，20世纪90年代以来，已经报道有十多种检测基因组甲基化水平的方法，如HPLC、MSAP、MSP、COBRA、DHPLC和RLGS等(邢世岩等, 2009)。MSAP技术与AFLP (扩增片段多态性)技术过程相似，MSAP技术采用两种对DNA甲基化敏感性不同的同裂酶(HpaⅡ, MspⅠ)和一个对DNA甲基化不敏感的内切酶EcoRⅠ组合，对基因组DNA进行双酶切，再接上相应的限制性内切酶的接头，然后利用接头序列设计预扩增引物进行PCR扩增，将扩增产物稀释后，利用选择性扩增引物进行PCR扩增。MSAP技术不需要知道被测DNA的序列信息，在不同生物上具有通用性，并且MSAP技术可以检测植物不同品系的DNA甲基化差异，因此，本研究采用此方法对11株叶籽银杏进行酶切位点的甲基化分析，分析不同单株的叶籽银杏间DNA甲基化的差异性，探明不同单株的叶籽银杏间甲基化水平和模式的差异，以期为叶籽银杏表观遗传学研究提供参考依据，为正确认识叶籽银杏的变异机制奠定基础。

1结果分析
1.1不同单株叶籽银杏甲基化模式分析
用MSAP技术对11株叶籽银杏进行了DNA甲基化图谱的构建(图1)。MSAP中HpaⅡ和MspⅠ两种酶的酶切位点相同，但对酶切位点的甲基化修饰敏感性不同，HpaⅡ对全甲基化位点(双链甲基化)不敏感，但能识别非甲基化位点和半甲基化位点(单链甲基化)；MspⅠ对半甲基化位点不敏感(单链甲基化)，但能识别非甲基化和全甲基化位点。因此，样品DNA经EcoRⅠ/HpaⅡ(H)和EcoRⅠ/MspⅠ(M)酶切后的产物在聚丙烯酰胺凝胶上会出现如下四种甲基化类型：A型，E+H和E+M都有带，表明CCGG位点未发生甲基化(非甲基化位点)；B型，E+H有带，E+M无带，表明CCGG位点发生单链DNA外甲基化(半甲基化位点)；C型，E+H无带，E+M有带，表明CCGG位点发生双链DNA内甲基化(全甲基化位点)；D型，E+H和E+M都无带，这种情况较复杂，一般不计入甲基化水平的范围。

图1 11株叶籽银杏单株基因组DNA的MSAP扩增图谱 注: a: 非甲基化位点; b: 半甲基化位点; c: 全甲基化位点; d: 不确定情况; H: EcoRⅠ+HpaⅡ双酶切; M: EcoRⅠ+MspⅠ双酶切; Mk: DL1500 marker; A: 引物为EA03B-TAG; B: 引物为EA04B-TTC Figure 1 MSAP fingerprints of 11 different plants genomic DNA (Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak.) Note: a: Non-methylation sites; b: Hemi-methylation sites; c: Fullmethlation sites; d: uncertainty; H: EcoRⅠ+HpaⅡ double digestion; M: EcoRⅠ+MspⅠdouble digestion; Mk: DL1500 marker; A: EA03B-TAG prime; B: EA04B-TTC prime

1.2不同单株叶籽银杏甲基化修饰水平的分析
本研究从36对MSAP选扩增引物中选出14对引物组合获得了图谱清晰、多态性丰富的MSAP图谱，共扩增产生2 879条清晰可辨的DNA条带，平均每个样品每对引物扩增获得18.7 (2879/11/14)条带。在全部扩增位点中，检测到甲基化位点1 212个，比例为42.14%。其中，内侧胞嘧啶甲基化(全甲基化)位点为717个，占全部扩增位点的24.04%；外侧胞嘧啶甲基化(半甲基化)位点为495个，占全部扩增位点的17.09%。11株叶籽银杏总体DNA基甲基化水平为36.86%~46.43%。其中，外侧胞嘧啶甲基化(全甲基化)水平为11.90%~23.90%，内侧胞嘧啶甲基化(半甲基化)水平为17.03%~28.37%，由此可知，11株叶籽银杏DNA甲基化模式以内侧胞嘧啶的甲基化为主。在所有单株中山东沂源的叶籽银杏(YZ6) DNA甲基化水平最高，为46.43%，山西太谷的叶籽银杏(TG)DNA甲基化水平最低，为36.86%，不同单株的叶籽银杏间DNA甲基化水平有明显差异(表1)。

表1 不同单株叶籽银杏DNA甲基化修饰水平的分析 Table 1 Analysis of methylation polymorphisms of different Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak. plants

1.3不同单株叶籽银杏间的聚类分析和主成分分析
根据甲基化敏感多态性技术获得的0，1矩阵，使用NTSYSpc软件中UPGMA对11个叶籽银杏单株进行了聚类分析和主成分分析。从图2中可以看出，当遗传相似系数为0.71时，YZ5、YZ1、TC2和NS2单株为第一类；TG、TC1和YZ6单株为第二类；WY、TC3、GX3和GX1单株为第三类。从图3可以看出，当遗传相似系数为0.72时，YZ5、YZ6、WY、GX1、GX3、TC3、TC1、NS2和TG单株为第一类；TC2单独为第二类，与云南腾冲的其它单株亲缘关系较远；YZ1单株单独为第三类，说明这个单株比较特殊，与山东的其它单株间亲缘关系较远。通过HpaⅡ、MspⅠ甲基化多态性数据获得的聚类图得出，四川万源和云南腾冲的单株有较近的亲缘关系，其它单株并没有表现出较近的亲缘性，并且地区相近的单株并没有聚为一类，没有表现出一定的地域性。

图2 11株叶籽银杏的UPGMA聚类图(用HpaⅡ数据) Figure 2 UPGMA dendroam for 11 Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak. samples (using HpaⅡ data)

图3 11株叶籽银杏的UPGMA聚类图(用MspⅠ数据) Figure 3 UPGMA dendroam for 11 Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak. samples (using MspⅠ data)

同样，用DNA多态性数据进行了主成分分析，其中，图4A第一维度代表了总变异的19.33%，第二维度代表了总变异的14.83%。图4B第一维度代表了总变异的15.80%，第二维度代表了总变异的13.90%。主成分分析(图4A; 图4B)都是第一维度贡献的变异大，主成分分析进一步验证了聚类结果，地区相近的单株并没有聚为一类，没有表现出一定的地域性。

图4 11株叶籽银杏主成分分析图 注: A: 样品在HpaⅡ酶切后获得的数据; B: 样品在MspⅠ酶切后获得的数据 Figure 4 Principle component analysis of 11 Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak. Note: A: Samples based on data of HpaⅡ; B: Samples based on data of MspⅠ

2讨论
MSAP技术是在AFLP (扩增片段多态性)基础上建立起来的分子标记技术，它是一种基于选择性PCR并结合了AFLP优点的新技术，1997年首次被用来检测双相型真菌的DNA甲基化，之后被广泛应用于拟南芥、西瓜、杉木和苏铁等植物上(Cervera et al., 2002; Nimmakayala et al., 2011; 洪舟等, 2009; Sae-Eung et al., 2012)，评估胞嘧啶甲基化的水平和模式。HpaⅡ对全甲基化位点(双链甲基化)不敏感，MspⅠ对半甲基化位点不敏感(单链甲基化)，两种酶都不能酶切的DNA，形成较大的DNA片段，可能导致PCR扩增失败，并且只能检测CCGG位点的DNA甲基化，因此，检测到的甲基化水平可能比实际要低，但一些资料表明，两种酶不能识别的前述甲基化类型出现的频率很低(Cervera et al., 2002)。综上原因，我们计算得到的DNA甲基化水平是相对水平，洪舟等(2009)称之为“DNA甲基化相对程度”，即本实验中不同单株叶籽银杏DNA甲基化相对程度在36.86%~46.43%之间。

本研究通过36对引物组合筛选获得了14对有效的引物组合，扩增产生DNA甲基化修饰位点1 212个，叶籽银杏甲基化修饰水平42.14%，其中全甲基化水平为24.04%，半甲基化水平为17.09%，与李际红(2011)叶籽银杏基因组中DNA甲基化水平为48.7% (全甲基化34%, 半甲基化14.7%)相比略低。不同物种或同一物种的不同生长时期DNA甲基化水平有很大的差异，如脐橙DNA甲基化水平为4.7%~ 15.0% (洪柳和邓秀新, 2005)，栗树DNA甲基化水平相比为13.7%~35.0% (Hasbún et al., 2005)，而牡丹休眠期间花芽的DNA甲基化水平在60%以上(盖树鹏等, 2012)，但有一点具有共性，即植物DNA非甲基化水平高与甲基化水平，且以内侧胞嘧啶甲基化为主。Zhang等(2006)报道植物研究中基因组DNA甲基化水平在4.7%~45%之间，充分反映了物种间DNA甲基化的差异性。

11株叶籽银杏的UPGMA聚类分析和主成分分析结论一致，分别用EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ两种酶组合获得的多态性数据进行聚类，地区相近的单株并没有聚为一类，这与李保进(2008) MatK序列构建的叶籽银杏邻接树相一致，叶籽银杏DNA甲基化的发生与地理位置无关，没有表现出一定的地域性。这与Fang等(2010)在57个甜橙品种的聚类结果一致，DNA甲基化变异具有多样性，不同品种之间没有表现出亲缘关系。比较研究辐射松、巨杉、红豆杉等木本植物中普遍存在DNA甲基化多态性(Fraga et al., 2002; Monteuuis et al., 2008; 李丽琴等, 2009)，且内侧胞嘧啶甲基化高于外侧胞嘧啶甲基化，与本研究结果一致。

 Wagner和Capesius (1981)研究认为DNA胞嘧啶甲基化作为一种古老的进化机制，它可能促进了基因组的进化，并在维持基因组稳定性和调节基因表达活性方面起着重要作用。DNA甲基化修饰在生长、发育、器官分化和基因表达调控等过程中发挥着重要作用(Finnegan et al., 1998)。基因甲基化模式的改变和甲基化水平的高低都可能影响植物的花期、育性、花和叶片及植株的形态等，导致植物生长发育的形态异常(Bird and Wolffe, 1999; Bender, 2004)。叶籽银杏这一变异是如何形成的呢?目前有关叶籽银杏的发生机制主要有返祖学、衰老学说、环境诱变学说及一种嵌合体学说(李士美等, 2007)，这一问题一直以来都没有一个很好的解释，国内多数学者支持“返祖学说”。最近研究发现，不同倍性的西瓜区别于亲本的性状可能与表观遗传调控有关(王春国等, 2009, 分子细胞生物学报, 42(2): 118-125)。薛京伦等(2006)指出表观遗传学最终导致了表型的变化。DNA甲基化修饰作为细胞记忆的一种机制，是表观遗传学研究的重点。关于结构和功能基因与表观遗传学之间的相互作用的说法很多，并伴随着潜在表型的选择，栽培西瓜的表观遗传多样性信息有助于我们理解其表型的可塑性(Nimmakayala et al., 2011)。邢世岩等(2006)对叶籽银杏属于树体衰老机制的说法提出了异议。李际红(2011)推测叶籽银杏的DNA甲基化修饰机理支持叶籽银杏形成的返祖学说。本研究推测叶籽银杏这一特异种质的变异可能与DNA甲基化有关，本课题组正在进行叶籽银杏与正常银杏差异位点的研究，以期找到叶籽银杏形成这一变异的关键基因，解开叶籽银杏发生之谜。

3材料与方法
3.1材料
2011年春在山东农业大学叶籽银杏种质资源库，采集来自不同地区的11株5年生叶籽银杏的新鲜嫩叶(表2)，采样部位为树冠上、中、下各部分混合采样，经去离子水冲洗后用吸水纸吸去多余水分，用锡箔纸包好，放入带有液氮的水壶中，带回实验室，置于-70℃冰箱中保存备用。

表2 叶籽银杏实验材料来源 Table 2 The origin of experimental materials Ginkgo biloba L. var. epiphylla Mak.

3.2方法
3.2.1 DNA提取
采用改良的CTAB法，根据李保进(2008)的方法稍作修改，采用氯仿/异戊醇多次抽提，提取叶片基因组DNA。所提DNA分别经1.0%的TAE琼脂糖凝胶电泳检测和核酸分析仪检测后，-20℃备用。

3.2.2 MSAP分析
分别用EcoRⅠ+HpaⅡ、EcoRⅠ+MspⅠ两种酶组合，对基因组DNA进行37℃酶切过夜，16℃连接过夜，接上接头，然后进行两次PCR扩增、用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、银染检测，最后进行数据统计并拍照保存。EcoRⅠ接头及引物序列以Vos等(1995)序列为参照，HpaⅡ (MspⅠ)接头及引物序列以Xiong等(1999)等序列为参照，具体引物参考李际红(2011)，所用引物见表3，引物序列委托上海生工合成。

表3 叶籽银杏DNA甲基化研究所用的引物对 Table 3 Sequence of adapters and primers used for MSAP analysis

3.2.3数据分析
 MSAP技术采用双酶切，因此每个样品同时拥有两条泳道，其中第一条带采用EcoRⅠ/HpaⅡ进行酶切，第二条带采用EcoRⅠ/MspⅠ酶切。根据泳道内条带的有无，将电泳图谱上清晰且可重复出现的条带记为“1”，同一位置没有条带记为“0”。用Excel计算每个引物扩增出的总条带数和甲基化比例。用NTSYSpc软件对分子标记数据进行UPGMA聚类分析和主成分分析。

作者贡献
王聪聪是本研究的实验设计和实验研究的执行者，并完成数据分析及论文写作；李际红指导实验设计和实验研究的进行；姚培娟和吴岐奎参与实验的研究；邢世岩是项目的构思者及负责人，指导实验设计、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终版本。

致谢
本研究得到国家自然基金项目(32070589)的资金支持。感谢山东农业大学农业生态与环境重点实验室提供实验仪器设备上的便利。

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