蛋白质双向电泳技术作为蛋白质组学研究的关键技术之一，已经广泛应用于不同植物组织器官中蛋白质的差异研究(Komatsu, 2005; Nozu et al., 2006)、植物病理学研究(Chen et al., 2007)，以及植物对逆境反应的分子机理研究等(Manaa et al., 2011; Chen et al., 2011)。但是，目前蛋白质双向电泳技术在植物蛋白组学应用中还存在很多问题，尤其是从一些特殊材料、器官中获得高纯度蛋白质常常非常困难(Rose et al., 2004)，影响到蛋白质双向电泳分离效果。因而，针对特定的组织或器官探究更好的蛋白质提取方法就成为蛋白质双向电泳技术改良的重要内容之一。

水稻根系直接与水、土壤和空气相接触，是吸收水分和营养物质的重要组织器官(Gowda et al., 2011)。当根系遭受养分亏缺、干旱、高盐以及重金属胁迫时，会限制整个植株的生长发育(Manaa et al., 2011; Steppuhn and Raney, 2005)。因此，相比水稻叶片蛋白组的反应，探究水稻根系蛋白组的变化显得尤为重要。但是，提取根系蛋白质时，水稻根系中的色素、糖类、酚类等次生代谢物不易清除干净(Sheoran et al., 2009)，这些物质的存在，会导致电泳图谱上出现横条纹、纵条纹和蛋白质拖尾等问题(Chen et al., 2011; Sheoran et al., 2009)。多位研究者根系蛋白质双向电泳分离效果不理想(郭广芳等, 2010; 陈丽等, 2010; Sun et al., 2011)。因而，探求优良的根系蛋白质提取方法，得到盐离子浓度较低、不含非蛋白物质的蛋白质样品是试验成败关键(Blackstock and Weir, 1999; Sheoran et al., 2009; Chen et al., 2011)。建立适用于水稻根系蛋白质双向电泳分离的蛋白质提取方法，对水稻根系蛋白质组学研究具有重要意义。

本研究对常用的蛋白质提取方法——TCA/丙酮/SDS法进行了改良，利用改良的TCA/丙酮/SDS法和TCA/丙酮法、TCA/丙酮/Tris-HCl法提取水稻根系蛋白质，并采用不同的上样量进行蛋白质双向电泳，从而明确水稻根系蛋白质更适宜的提取方法和蛋白上样量，提高水稻根系蛋白质双向电泳图谱的分辨率，为水稻根系蛋白质组学研究奠定技术基础。

1结果与分析
1.1不同水稻根系蛋白质提取方法对2-DE图谱的影响
改良的TCA/丙酮/SDS法和TCA/丙酮法、TCA/ 丙酮/Tris-HCl提取方法得到的水稻根系蛋白质2- DE图谱比较发现(图1; 图2)，改良的TCA/丙酮/ SDS法能够得到更多数目的蛋白质点(181个) (图3)，并且蛋白质点的形状更具规则性，蛋白质点更清晰(图1C; 图2C)。用TCA/丙酮法，可以得到的蛋白质点数目次之(131个)，但是蛋白质分离效果远不如改良的TCA/丙酮/SDS法(图1B; 图1C)。用TCA/丙酮/Tris-HCl法得到蛋白质点数目最少(88个)，并且蛋白质分离效果最差(图1A)。

图1 不同水稻根系蛋白质提取方法2-DE图谱的比较 注: A: TCA/丙酮/Tris-HCl; B: TCA/丙酮; C: TCA/丙酮/SDS Figure 1 Comparison of 2-DE images of rice root protein extracted by different extraction methods Note: A: TCA/Acetone/Tris-HCl; B: TCA/Acetone; C: TCA/Acetone/SDS

图2 不同提取方法局部2-DE图谱的比较 注: A: TCA/丙酮/Tris-HCl; B: TCA/丙酮; C: TCA/丙酮/SDS Figure 2 Comparison of parts in 2-DE images by different extraction methods Note: A: TCA/Acetone/Tris-HCl; B: TCA/Acetone; C: TCA/Acetone/SDS

图3 不同水稻根系蛋白质提取方法获得的蛋白质点数量 注: a: TCA/丙酮/Tris-HCl; b: TCA/丙酮; c: TCA/丙酮/SDS Figure 3 Amount of obtained spots of rice root protein extracted by different extraction methods Note: a: TCA/Acetone/Tris-HCl; b: TCA/Acetone; c: TCA/Acetone/SDS

1.2蛋白质上样量对2-DE图谱的影响
利用改良的TCA/丙酮/SDS法提取水稻根系蛋白质为样品，设置4个蛋白质上样量300 μg、350 μg、500 μg和700 μg进行电泳(图4)。发现上样量为350 μg获得384个蛋白质点(图5)。相比上样量为300 μg，上样量为350 μg时，微量表达的蛋白质得以显现(图4A; 图4B)，2-DE蛋白质图谱的分辨率达到更高的程度。但是，随着上样量的加大，到500 μg (图4C)和700 μg(图4D)，蛋白质点个数非但没有增加，反而降低，并且当上样量过多，胶图背景颜色变深、蛋白质点有相互重叠的现象(图4C; 图4D)。

图4 不同上样量2-DE图谱的比较 注: A: 上样量300 μg；B: 上样量350 μg；C: 上样量500 μg；D: 上样量700 μg Figure 4 Comparison of 2-DE images of different loading amount Note: A: 300 μg protein sample; B: 350 μg protein sample; C: 500 μg protein sample; D: 700 μg protein sample

图5 不同上样量获得的蛋白质点数目 Figure 5 Amount of obtained spots of protein from different loading amount

2讨论
蛋白质双向电泳常出现拖尾、横条纹、纵条纹的现象，严重影响蛋白质的分离效果，从而影响蛋白质组学研究的结果。这些问题产生的原因有以下几方面：样品中非蛋白质物质的干扰、上样量过大、样品溶解不好、样品中盐离子浓度过高、平衡时间过短、聚焦时间设置不合理(Gǒrg et al., 2004)。选择适宜的蛋白质提取方法，能够降低样品中盐离子浓度，避免非蛋白质物质的干扰获得高纯度的蛋白质(Chen et al., 2011; Sheoran et al., 2009)。

有关植物组织蛋白质提取方法的研究有很多(Damerval et al., 1986; Sheoran et al., 2009; 曾广娟等, 2009; 梁书剑等, 2009; Zhu et al., 2011)，然而，没有一种方法适用于所有植物组织。在以上众多的蛋白质提取方法中，TCA/丙酮沉淀法、Tris-HCl/苯酚抽提法以及SDS/苯酚抽提法相对较好，而且在植物蛋白质组学研究(Sun et al., 2011; Wang et al., 2006)中已被广泛应用。但是，由于根系组成成分复杂、研磨的困难，影响根系中色素类、酚类和醌类等物质的清除(Cánovas et al., 2004)。

TCA/丙酮法是最常见的蛋白质提取方法，但是对于一些酚类、醛类等物质达不到彻底的清除，容易使蛋白图谱上产生纵条纹，并且这些酚类、醛类物质的存在，在某种程度上掩盖了一部分蛋白质点，使2-DE图谱达不到理想的分离效果(Gǒrg et al., 2004 ; Carpentier et al., 2005)。此外，该方法不能够有效地清除样品中含有的盐离子，致使蛋白样品聚焦受到影响，从而产生横条纹(Gǒrg et al., 2004)。

利用TCA/丙酮/Tris-HCl法提取蛋白，由于TCA是酸性物质，样品中TCA常常去除不干净，降低Tris提取液的pH值，影响到蛋白质的溶解和样品提取过程中蛋白的丢失，得到的2-DE图谱(图1A)蛋白点的数目少(郭广芳等, 2010)。本研究改良的TCA/丙酮/SDS法是在TCA/丙酮法的基础上，充分利用丙酮干粉脆质的特点，增加了丙酮干粉的再次研磨，然后将二次研磨制备的丙酮干粉溶解在SDS提取液中，在研钵中研磨成匀浆状态，使丙酮干粉在提取液中充分溶解，再用Tris饱和酚进行抽提，有效地清除核酸、多糖、酚类、醛类物质和盐离子(Chen et al., 2011)，获得高纯度的蛋白质样品，从而可以获得蛋白质点数目多、清晰度高的双向电泳图谱。李红兵和康振生(2011)指出TCA/丙酮沉淀一酚/SDS抽提法适用于小麦叶片蛋白组分析，不同的是改良的TCA/丙酮/SDS法在TCA/丙酮沉淀一酚/SDS抽提法的步骤中增加了丙酮干粉二次研磨，使丙酮干粉更细，然后加入预冷丙酮研磨，转入离心管，离心后用预冷丙酮重复洗涤沉淀，以达到清除色素类、糖类、脂类和醌类等物质的目的。因此，改良的TCA/丙酮/SDS法更适用于水稻根系蛋白质提取。

上样量的多少会影响到2-DE图谱的蛋白质点数目和种类(Gǒrg et al., 2000)。上样量过小会导致低丰度蛋白在2-DE图谱上显示不清晰，检测不到。上样量过大，低丰度蛋白得以显示，但是高丰度蛋白点也会变得较大，出现蛋白点重叠、串联现象，掩盖住分子量相近的低丰度蛋白，影响蛋白质的分离效果。本研究在IPG预制胶条规格为17 cm、pH 4~pH 7的条件下，运用4个上样量进行双向凝胶电泳，发现上样量350 μg，2-DE图谱蛋白质分离效果好、蛋白点数目多。大量蛋白组学研究(郭广芳等, 2010; Manaa et al., 2011)比较发现，上样量的大小与预制胶条的长度、pH范围、植物组织等多种因素有关。此外，使蛋白裂解液、平衡母液、低熔点琼脂糖封胶液等各种溶液中的溶质彻底溶解；上样前进行20~30 min的样品高速离心，除掉样品中含有的不溶物等措施也可以提高根系蛋白质双向电泳图像的质量。

本研究运用改良的TCA/丙酮/SDS法与TCA/丙酮法、TCA/丙酮/Tris-HCl法相比较，明确了改良的TCA/丙酮/SDS法适用于水稻根系蛋白组分析，确定了350 μg是改良的TCA/丙酮/SDS法获得高质量的双向电泳图谱的最佳上样量，为水稻根系蛋白组学分析奠定了良好的技术基础，对根系差异蛋白组学研究具有重大的现实意义。

3材料与方法
3.1试验材料
水稻种子用10%过氧化氢表面消毒10 min，无菌水冲6次(2 min/次)，然后置于无菌水中浸泡24 h，置于湿纱布上，32℃催芽2 d，将萌发的种子放置于底部粘有纱布的泡沫塑料孔板上，每孔5粒，将泡沫板漂于盛满蒸馏水的盒子中，培养1周，再用全营养液进行培养(吉田昌一等, 1975, 科学出版社, pp.57-64)。3叶期将水稻苗固定于装满营养液的塑料盒中，每盒30株，每2天调节pH值，使pH值保持在5.5左右，每周更换1次营养液。于6叶期，取水稻根系，液氮速冻，存放在-80℃冰箱中备用。

3.2试剂及设备
载体两性电解质Bio-Lyte (3-10)和ReadyStrip IPG Strip (17 cm, pH 4~pH 7)购于美国BIO-RAD公司；尿素(Urea)、二硫苏糖醇(Dithiothreitol, 缩写: DTT)、碘乙酰胺(Iodacetamide)、过硫酸铵(AP)、3- [(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250、十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate, 缩写: SDS)、甘氨酸、低熔点琼脂糖和硫脲(Thiourea)购自Sigma公司。其它试剂均为国产分析纯试剂。样品离心采用Beckmen64R高速低温离心机，双向电泳图像采用PDQuest图像分析软件进行。

3.3水稻根系蛋白质样品制备方法
3.3.1 TCA/丙酮法
水稻根系鲜样1 g用液氮研磨成粉末。在研钵中加入三氯乙酸/丙酮提取液(10%三氯乙酸(Trich loroacetic acid, 缩写: TCA), 含0.07% β-巯基乙醇) (Damerval et al., 1986; Sheoran et al., 2006)，研磨直至组织破碎。将研钵中混合物转移至离心管中，混合震荡，使组织与提取液充分接触。将装有混合液的离心管-20℃冰箱静置3 h。18 000×g，4℃，离心30 min。弃上清，沉淀中加入-20℃预冷丙酮(含0.07% β-巯基乙醇)，混合震荡。放-20℃冰箱静置30 min以上。18 000×g，4℃，离心30 min。重复以上向离心管中的沉淀中添加预冷丙酮-混合震荡-静置-离心的操作，至上清为无色时，弃上清，剩余沉淀放超净工作台上，晾至干粉状态。所得干粉-80℃保存，用于双向电泳分析。

3.3.2 TCA/丙酮/Tris-HCl法
TCA/丙酮方法制得的丙酮干粉，加Tris提取液(0.1 mol/L, pH 7.8) (Wang et al., 2006; Zhu et al., 2011)，在研钵中研磨至匀浆，转移至离心管中，混合均匀。静置片刻或直接20 000×g，4℃，离心15 min。取上清，在沉淀中加Tris提取液重提，弃沉淀。所得上清分装于离心管中，加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀，静置片刻或直接20 000×g，4℃，离心15 min。取下层酚相分装于离心管中，加入5倍体积的乙酸铵/甲醇，混合均匀。-20℃静置30 min以上(或过夜)，20 000×g，4℃离心15 min，弃上清。所得沉淀用-20℃丙酮洗涤3~5次，制干粉。-80℃保存用于双向电泳分析。

3.3.3改良的TCA/丙酮/SDS法
参照Wang等(2003)方法，但是在丙酮干粉制备和SDS提取液配制步骤中进行了改进。充分利用丙酮干粉脆质性的特点，把TCA/丙酮方法制得的丙酮干粉在研钵中再次研磨，然后加入-20℃预冷丙酮研磨至匀浆状态，然后转移到离心管中，混合震荡。将装有混合液的离心管-20℃冰箱静置30 min，18 000×g，4℃，离心30 min，弃上清，在离心管中加入-20℃预冷丙酮，混合震荡，放置于-20℃冰箱静置30 min，然后离心，弃上清，留沉淀。重复以上向离心管中的沉淀中添加预冷丙酮-混合震荡-静置-离心的操作3~5次。剩余沉淀放超净工作台晾至干粉状态。将二次研磨制备的丙酮干粉倒入研钵中，加入SDS提取液(2% SDS, 5 mmol/L DTT, 0.5 mmol/L EDTA-Na2, 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.8)，在研钵中研磨使成匀浆，转移至离心管中，混合均匀。静置片刻或直接20 000×g，4℃，离心15 min。取上清，沉淀中加入SDS提取液进行重提，弃沉淀，所得上清与以上清混合。所得上清分装于离心管中，加入等体积的Tris饱和酚，震荡、混匀。静置片刻或直接20 000×g，4℃，离心15 min。取下层酚相分装于离心管中，加入5倍体积的乙酸铵/甲醇，混合均匀。-20℃静置30 min以上(或过夜)，20 000×g，4℃，离心15 min，弃上清。所得沉淀用丙酮洗涤3~5次，制干粉。-80℃保存。

3.4蛋白质的溶解和定量
将以上3种方法获得的干粉溶解在蛋白质溶解液(8 mol/L urea, 2 mol/L thiourea, 4% CHAPS, 40 mmol/L DTT)中，振荡至匀浆胶状液体，28℃水浴过夜。20 000×g，20℃，离心40 min，取上清，弃沉淀。蛋白浓度测定参考Bradford (1976)的方法。

3.5等电聚焦
将含蛋白质样品的溶液经20 000×g离心30 min后，从-20℃冰箱取出IPG胶条放置于室温10 min，在水化槽中加入300 μL溶解有蛋白质样品的水化上样液后，将IPG胶条保护膜撕下，胶面朝下压在水化液上，避免气泡出现。然后再胶条上覆盖2 mL矿物油，盖上水化槽的盖子。放置于IPG等电聚焦仪上，进行水化和等电聚焦。水化和等电聚焦参数见表1。

表1 第一向等电聚焦条件 Table 1 Isoelectric focusing conditions in first phase

3.6胶条平衡
待等电聚焦完成后，用去离子水冲去胶条表面的矿物油，将IPG胶条在10 mL平衡液Ⅰ中平衡15 min，之后用去离子水冲去胶条表面的平衡液Ⅰ(6 mol/L尿素, 4%十二烷基硫酸钠, 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8, 20%甘油, 80 mmol/L二硫苏糖醇(现加)。再在10 mL平衡液Ⅱ (6 mol/L尿素, 4%十二烷基硫酸钠, 50 mmol/L Tris-HCl pH 8.8, 20%甘油, 135 mmol/L碘乙酰胺(现加)中平衡15 min，然后用去离子水冲去胶条表面的平衡液Ⅱ，用湿润的滤纸吸去胶条上多余的水分。

3.7 SDS-PAGE
将平衡后的IPG胶条转移至1 mm厚的12%的分离胶上，避免使胶条与凝胶表面产生气泡，用低熔点琼脂糖封胶液(0.5%低熔点琼脂糖, 25 mmol/L Tris, 0.5%十二烷基硫酸钠, 192 mmol/L甘氨酸, 0.001%溴酚蓝)封住顶部。将装有IPG胶条的玻璃板放置在电泳槽中进行电泳(10℃, 前30 min 50 V, 后200 V)。

3.8图像扫描和分析
待电泳结束后，对凝胶进行固定(乙醇40% (v/v), 乙酸10% (v/v) 1 h，用超纯水漂洗2~3次，再转移至500 mL染色液(10%磷酸(v/v), 10%硫酸铵(w/v), 20%乙醇(v/v), 0.12%考马斯亮蓝G-250(w/v)中染色2 h，放置去离子水中脱色至背景为白色。固定、染色、脱色整个过程都在摇床上进行。脱色后的凝胶用扫描仪获取图像，用PDQuest图像分析软件分析。

作者贡献
秦利征、赵全志、李俊周是本研究的实验设计和实验研究的执行人；秦利征完成了数据分析和论文初稿的写作；李俊周、赵全志是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由河南省高校科技创新团队支持计划项目(2010IRTSTHN005)、河南省重大公益性科研招标项目和郑州市节水农业重点实验室建设项目(112PYFZX185)共同资助。河南农业大学王伟老师和博士研究生彭廷在实验操作和论文的写作方面提出宝贵的建议，在此表示衷心的感谢。

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