巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell. Arg)是多年生异花授粉的高大乔木，采用常规育种方法选育新品种难度大，周期长。植物组织培养技术和基因工程技术的发展为橡胶树品种改良和种质创新提供了新的途径，利用转基因技术可以对橡胶树性状进行定向改良，并缩短橡胶树选育种周期。近年来，随着橡胶树组织培养技术的不断发展，研究人员已经建立了花药(王泽云等, 1980)、内珠被(Carron, 1981; 李哲等, 2010)、无菌根(Zhou et al., 2010)等材料为外植体的植株再生体系。在此基础上，橡胶树遗传转化研究也取得了重大进展，马来西亚(Arokiaraj and Wan Abdul Rahaman, 1991; Arokiaraj et al., 1996; 1998; 2009)、法国(Montoro et al., 2000; 2003; Blanc et al., 2006; Leclercq et al., 2010)、印度(Jayashree et al., 2003)和中国(黄天带等, 2010)的科研工作者先后建立了橡胶树遗传转化体系，并获得转化植株。

在植物转基因研究中，从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)基因组中克隆的bar基因被广泛用作一种显性的选择标记。由于bar基因是以单基因显性方式遗传，所以较容易筛选出bar基因的转基因后代，同时转基因作物也可获得一个抗除草剂的性状。bar基因编码磷化麦黄酮乙酰转移酶(PAT)，该酶在酶学和免疫学上有可分析性，因此bar基因也可作为一个报告基因。在Western杂交中，5 ng的PAT即可被检出，因此bar基因可用来分析转化植株的基因表达以及表达水平高低(De Block et al., 1987)。bar基因现已被成功应用于大麦(Wan and Lemaux, 1994)、水稻(Rathore et al., 1993; 崔广荣等, 2004)、杨树(Igasaki et al., 2002)、兰花(Knapp et al., 2000)、玉米(张明义等, 2011)、甘薯(臧宁等, 2008)和小麦(张媛媛等, 2005)等多种植物的遗传转化研究中。

双丙氨磷是由吸水链霉菌(S. hydroscopius)发酵产生的一种有机磷双肽化合物，由两个丙氨酸残基和谷氨酸组成。它是一种非选择性除草剂，对单子叶和双子叶植物均有效，已被应用于植物转基因植株的筛选。在植物遗传转化研究中，常以硫酸卡那霉素、潮霉素B、Basta等作为筛选剂，而在橡胶树遗传转化研究中常用的筛选剂为硫酸卡那霉素(Arokiaraj et al., 1998; 2009; Jayashree et al., 2003; 黄天带等, 2010)和巴龙霉素(Montoro et al., 2000; 2003; Blanc et al., 2006; Leclercq et al., 2010)，这两种筛选剂都是以nptⅡ基因为筛选标记基因，以双丙氨磷(Bialaphos)作为筛选剂的研究还尚未见报道。为了探索新的筛选基因在橡胶树遗传转化中的应用，本研究以橡胶树胚性愈伤组织为受体材料，利用bar基因作为筛选标记基因，研究了双丙氨磷对橡胶树遗传转化中抗性愈伤组织筛选效率的影响。

1 结果与分析
1.1不同浓度双丙氨磷对橡胶树胚性愈伤组织生长的影响
将愈伤组织在含有不同浓度双丙氨磷的M1培养基中进行培养，25 d后对其生长状态进行观察。结果表明，在未添加双丙氨磷的培养基中，愈伤组织状态良好(图1A)；而在添加有双丙氨磷的培养基中，愈伤组织的生长受到抑制，出现不同程度的褐化。其中在添加1 mg/L双丙氨磷的M1培养基中，愈伤组织呈暗黄色，接触培养基的愈伤组织停止生长，但未直接接触培养基的愈伤组织仍有生长(图1B)；在添加2 mg/L双丙氨磷的培养基中，接触培养基的愈伤组织出现褐化，未直接接触培养基的愈伤组织生长缓慢(图1C)；当浓度提高到3 mg/L时，愈伤组织褐化，生长基本受到抑制(图1D)；而当使用更高浓度5 mg/L时，愈伤组织较早出现褐化，基本褐死(图1E)；在浓度为10 mg/L的培养基中培养两周后愈伤组织全部褐化，25 d全部褐死，并出现水渍现象(图1F)。因此，双丙氨磷以3 mg/L的浓度能有效抑制愈伤组织的生长。

图1 不同浓度的双丙氨磷对橡胶树愈伤组织生长的影响 注: 将橡胶树热研8-79愈伤组织接种到添加有不同浓度双丙氨磷的M1培养基上, 25 d后观察愈伤组织生长情况; A: 未加双丙氨磷; B: 1 mg/L双丙氨磷; C: 2 mg/L双丙氨磷; D: 3 mg/L双丙氨磷; E: 5 mg/L双丙氨磷; F: 10 mg/L双丙氨磷 Figure 1 Effects of different bialaphos concentrations on growth of embyogenic calli of H. brasiliensis Note: Calli of rubber tree clone CATAS 8-79 were inoculated on M1 medium supplemented with different bialaphos concentration, and were observed after 25 d; A: 0 mg/L bialaphos; B: 1 mg/L bialaphos; C: 2 mg/L bialaphos; D: 3 mg/L bialaphos; E: 5 mg/L bialaphos; F: 10 mg/L bialaphos

1.2抗性愈伤组织的筛选和植株再生
在共培养结束后将愈伤组织转入AT1培养基中恢复生长15~20 d，待去除农杆菌后将愈伤组织转接到含有3 mg/L双丙氨磷的抗性筛选培养基上培养2~4代，新的抗性愈伤从已褐化的愈伤组织边缘长出(图2A)，本研究中共获得3个抗性愈伤组织系。待抗性愈伤组织系经增殖培养(图2B)后，分别将约10 g的抗性愈伤组织转入胚状体诱导培养基E1中，60 d左右愈伤组织再分化形成胚状体(图2C)，胚状体继续在E1培养基中培养30 d左右发育成熟，共获得234个成熟胚状体。将这些胚状体转入植株再生培养基中培养30~60 d，胚状体萌发获得再生植株，共获得22株再生植株(图2D; 图2E)。

图2 橡胶树转基因植株的获得 注: A: 抗性愈伤组织的获得; B: 抗性愈伤组织的继代; C: 抗性体细胞胚; D,E: 抗性再生植株 Figure 2 Acquirement of transgenic rubber tree plantlets Note: A: Resistant calli; B: Subculture of resistant calli; C: Resistant somatic embryos; D,E: Resistant plantlets of rubber tree

1.3抗性愈伤组织系及再生植株的PCR的检测
提取抗性愈伤组织的DNA，用bar基因和HbWRKY5基因的特异引物进行PCR鉴定，结果表明bar基因和HbWRKY5均整合到橡胶树基因组中(图3A; 图3B)。获得抗性再生植株后，以转化植株和未转化的再生植株叶片DNA及质粒为模板，其中未转化的再生植株为阴性对照，质粒pXCS-HbWRKY5-HAstrep为阳性对照，分别用bar基因和HbWRKY5基因的特异引物对再生植株进行PCR检测。扩增结果表明，所检测的抗性植株均能扩增出462 bp的bar基因，1 009 bp的内源HbWRKY5和789 bp的外源HbWRKY5；未转化植株只能扩增出内源HbWRKY5 (图3C; 图3D)。回收3~5号抗性植株的基因，内源HbWRKY5和外源HbWRKY5扩增产物进行测序，扩增产物与原基因序列相似性达到98%以上。以上检测结果表明，目的基因已成功转入再生植株中，且没有假阳性植株出现，以bar基因为选择标记的橡胶树遗传转化体系得到了初步建立。

图3 过表达HbWRKY5的橡胶树热研8-79抗性愈伤组织及再生植株的PCR检测 注: A: 抗性愈伤组织系的bar基因检测; B: 抗性愈伤组织系的HbWRKY5基因检测; C: 抗性植株的HbWRKY5基因检测; D:抗性植株的bar基因检测; M: 100 bp DNA ladder marker; 0: 空白对照; CK; 非转化的植株; +: 质粒pXCS-HbWRKY5-HAstrep; S1-S3: 抗性愈伤组织系; 1~22: 抗性植株 Figure 3 PCR identification of resistant callus lines and plantlets in rubber tree clone CATAS 8-79 overexpressed HbWRKY5 Note: A: Amplification banding pattern of bar gene in resistant callus lines; B: Amplification banding pattern of HbWRKY5 gene in resistant callus lines; C: Amplification banding pattern of HbWRKY5 gene in resistant plantlets; D: Amplification banding pattern of bar gene in resistant plantlets. M: 100 bp DNA ladder marker; 0: Blank control; CK: Non-transgenic plantlet; +: pXCS-HbWRKY5-HAstrep; S1-S3: Resistant callus lines; 1~22: Resistant plantlets

2讨论
目前用于植物遗传转化的抗性筛选基因主要是nptⅡ基因、hpt基因和bar基因，其中bar基因筛选体系具有快速简便、高效，细胞产生的假转化体少，并且使植物获得优良的抗除草剂农艺性状的优点(王相春等, 2011)。Igasaki等(2002)获得的白杨转化植株中无假阳性和嵌合体出现，认为由于双丙氨磷的作用原理使得采用双丙氨磷筛选比用卡那霉素筛选具有假阳性率低，嵌合体少等特点。Xu等(1996)将转化后的水稻愈伤组织，在添加有6 mg/L PPT的培养基上选择培养6周后，所获得的60多株再生植株中无一假阳性出现。在本研究中，当培养基中添加低浓度的双丙氨磷(<3 mg/L)时，愈伤组织的生长在前期受到抑制，而在后期能恢复正常生长，无法起到有效抑制非转化愈伤组织生长的作用；添加高浓度的双丙氨磷(>3 mg/L)时，愈伤组织会过早地褐化死亡，这也不利于转化愈伤组织的筛选；只有在添加3 mg/L的双丙氨磷时，既能抑制非转化愈伤组织的生长，又能保证阳性愈伤组织的生长。本研究中所获得的橡胶树转基因植株中没有出现假阳性和嵌合体，再次证实了采用bar基因和双丙氨磷进行转化筛选假阳性率低，没有嵌合体出现，说明在橡胶树遗传转化中应用bar基因和3 mg/L的双丙氨磷作为筛选体系是可行的。

在橡胶树的转化体系中，nptⅡ基因是目前最常用的筛选基因。黄天带等(2008)研究发现潮霉素B抑制橡胶树愈伤组织生长并抑制体胚发生，而本研究的研究结果则表明双丙氨磷对橡胶树抗性愈伤组织的正常生长和体细胞胚的诱导影响较小，从234个成熟的体细胞胚中共获得22株再生植株，植株再生率为9.4%，与非转基因愈伤组织的植株再生率相当。本研究首次在橡胶树遗传转化中实现利用bar基因作为选择基因获得转化植株，建立了以bar基因为选择标记的遗传转化体系，丰富了橡胶树遗传转化体系中的筛选基因种类。

3材料和方法
3.1试验材料
本研究以橡胶树热研8-79花药愈伤组织为转化受体材料。转化所用的工程菌株农杆菌GV3101::pMP90RK和表达载体pXCS-HbWRKY5-HAstrep均由本实验室保存。表达载体T-DNA区结构示意图见图4。HbWRKY5为本实验室从橡胶树中克隆，该转录因子开放阅读框cDNA序列为789 bp，DNA序列为1 009 bp。双丙氨磷购于Gold Biotechnology, Inc. USA。

图4 表达载体pXCS-HbWRKY5-HAstrep T-DNA区结构 Figure 4 T-DNA domain of expression plasmid pXCS-HbWRKY5-HAstrep

3.2试验方法
3.2.1组织培养条件
试验所用基本培养基为改良的MS培养基，其修改成份为500 mg/L MgSO₄·7H₂O，400 mg/L KH₂PO₄， 250 mg/L CaCl₂，35 mg/L MnSO₄·H₂O，0.2 mg/L CuSO₄· 5H₂O，添加不同附加成分，pH值为5.8，121℃高温高压灭菌20 min。愈伤组织培养及胚状体诱导培养均采用暗培养，植株再生培养光照周期为16 h光照，8 h黑暗，培养温度均为(27±1)℃。

研究中所用培养基及其成份如下：①愈伤组织培养基(M1)：改良的MS附加1.0 mg/L 2,4-D，1.5 mg/L NAA，1 mg/L KT，5% (v/v)椰子水，70 g/L蔗糖，2.2 g/L植物凝胶；②农杆菌重悬培养基(MS1)：改良的MS附加30 g/L蔗糖，10 g/L葡萄糖，100 mg/L AS，pH 5.2；③共培养培养基(C1)：M1附加100 mg/L AS，pH 5.2；④脱菌培养基(AT1)：M1附加300 mg/L特敏汀；⑤筛选培养基(S1)：M1附加200 mg/L特敏汀，3 mg/L双丙氨磷；⑥体细胞胚诱导培养基：改良的MS附加3.0 mg/L KT，0.1 mg/L NAA，1 mg/L BAP，0.1 mg/L GA3，5% (v/v)椰子水，2.0 g/L植物凝胶，50 g/L蔗糖；⑦植株再生培养基：改良的MS附加0.5 mg/L KT，0.2 mg/L IAA，0.5 mg/L GA3，50 g/L蔗糖，5% (v/v)椰子水，2.0 g/L植物凝胶。

3.2.2双丙氨磷筛选剂最佳浓度的确定
将橡胶树热研8-79愈伤组织接种到添加有不同浓度(0, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L, 5 mg/L和10 mg/L)双丙氨磷的M1培养基上，观察双丙氨磷对愈伤组织生长的影响，每个浓度设3次重复，每次重复接种10块愈伤组织。接种25 d后观察愈伤组织生长情况，并确定合适的抗性筛选浓度。

3.2.3根癌农杆菌转化和抗性愈伤组织的筛选
将15 g左右橡胶树热研8-79胚性易碎愈伤组织在农杆菌(菌液浓度OD₆₀₀=0.25-0.4)悬浮液中侵染3 min，用无菌滤纸吸干后转入C1培养基上，20℃~ 22℃共培养4~6 d。共培养结束后将愈伤组织转移到AT1培养基上进行恢复培养，25℃暗培养15~20 d。继而转入含有双丙氨磷的S1培养基上进行抗性愈伤筛选，每25 d继代1次，筛选2~4代后挑选出抗性愈伤组织继续增殖培养，并提取抗性愈伤组织基因组DNA进行PCR检测。

3.2.4体细胞胚诱导及植株再生
分别从PCR呈阳性的抗性愈伤组织系中，选取10 g愈伤组织转接到E1培养基上诱导体细胞胚发生，每25 d转接1次，90 d左右将成熟的体细胞胚转入植株再生培养基诱导植株再生。

3.2.5转化子的PCR检测和序列分析
以抗性愈伤组织DNA和再生植株叶片DNA为模板，用bar基因和HbWRKY5基因特异引物，进行PCR检测。转化植株叶片DNA提取参照安泽伟和黄华孙(2005)的方法。bar基因扩增产物为426 bp，外源HbWRKY5的扩增产物为789 bp，内源HbWRKY5的扩增产物为1 009 bp。PCR反应体系为10 μL，其中有模板DNA 20 ng，上下游引物各0.2 μmol/L，2×Taq Mix (北京百泰克生物技术有限公司) 5 μL，用ddH₂O补足10 μL。PCR扩增程序为94℃预变性4 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共32个循环；最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物回收后送北京华大基因科技股份有限公司测序，测序结果用DNAman进行序列比对分析。

作者贡献
谢黎黎和安泽伟是本研究的实验设计和实验研究的执行人；谢黎黎完成数据分析，论文初稿的写作；姜泽海、李雅超和翟琪麟参与实验设计，试验结果分析；安泽伟指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；黄华孙是项目的构思者及负责人。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家天然橡胶产业技术体系(CARS34)、国家自然科学基金项目(30860221; 30960319)和中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项(1630022011002)共同资助。作者感谢中国热带农业科学院橡胶研究所李维国研究员在本研究过程中提供的帮助。

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