Jacobsen等(1996)利用T-DNA标签法在拟南芥中最先克隆得到Spindly (SPY)基因。SPY基因在植物中呈组成型表达，其蛋白主要出现在细胞核。SPY蛋白与动物中的氧连N-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)具有广泛的同源性，两者可能有类似的作用机制。目前已从大麦、矮牵牛、番茄、水稻中克隆到SPY的同源基因(Robertson et al., 1998; Izhaki et al., 2001; Greb et al., 2002; Shimada et al., 2006)。SPY作为负调节因子参与GA的信号转导(Jacobsen et al., 1996)，SPY还作为正调节因子参与细胞分裂素、脱落酸的信号转导(Greenboim-Wainberg et al., 2005; Robertson, 2003)，也可能参与油菜素内脂、乙烯的信号转导(Shimada et al., 2006; Lin et al., 2008)。因此，SPY在植物激素的交叉作用(Cross talk)中起着非常关键的作用。SPY还在成花诱导、花分生组织属性建立、光周期反应、毛状体发生及非生物胁迫反应等中起重要作用(Silver- stone et al., 2007; Okamuro et al., 1997; Tseng et al., 2004; Gan et al., 2006; Qin et al., 2011)。

本研究通过在培养基中添加赤霉素和细胞分裂素的措施，建立了离体培养大岩桐花被切块高频率直接再生花芽的花芽分化研究体系(Pang et al., 2006; 2012)。由于SPY基因既是GA信号转导的负调节因子，又是细胞分裂素信号转导的正调节因子，而且SPY还在成花诱导、花分生组织属性的建立中起作用，因而推断SPY在离体培养大岩桐花被切块直接再生花芽的过程中起重要作用。为了进一步探讨SPY的功能及其在花芽分化中的作用机制，我们克隆了大岩桐的SPY同源基因，并通过农杆菌介导法转化烟草，初步研究了大岩桐SPY同源基因的功能。

1结果与分析
1.1 SsSPY基因的序列
根据SPY保守序列设计引物，以大岩桐幼叶的cDNA为模板，通过PCR扩增，获得中间片段，此片段的长度为613 bp (图1A)，Blastn分析显示，该片段与拟南芥SPY基因的部分序列有76%的同源性，与矮牵牛SPY同源基因的部分序列有82%的同源性。用RACE法分别获得3′端2 021 bp (图1B)和5'端1 750 bp (图1C)的目的片段。将已得到的三段序列(中间序列, 3'端序列和5'端序列)在DNAMAN软件中进行拼接，获得全长序列。最后通过设计全长引物扩增得到全长为3 410 bp的序列(图2)。

图1 SsSPY基因中间片段(A)、3'RACE (B)和5'RACE (C)的克隆 注: M: MarkerⅢ; 1: 目的片段; 2: 阴性对照 Figure 1 The cloning of the intermediate fragment (A), 3'RACE (B), 5'RACE (C) of SsSPY gene Note: M: MarkerⅢ; 1: The target fragment; 2: Control

图2 SsSPY基因全长的克隆 注: M: MarkerⅢ; 1: 全长片段 Figure 2 The cloning of the full length sequence of SsSPY gene Note: M: MarkerⅢ; 1: The full length sequence

利用DNAMAN软件及生物信息平台NCBI和ExPASy对SsSPY进行全序列分析，发现该序列包含一个完整的开放阅读框(ORF)，长度为2 805 bp，编码934个氨基酸(图3)。在序列3'端含有一个非编码区(488 bp)及一个植物典型的加尾信号G/AATAA_1-3和poly(A)15序列。全序列分析还显示该序列编码的氨基酸序列在N端的第47-434氨基酸处有10个重复的TPR结构(为34个氨基酸所组成的短肽)。而TPR结构正是SPY基因所共同具有的保守结构域。Blastp分析发现，SPY在各物种之间比较保守，特别是中间部分序列一致性很高。SsSPY与矮牵牛的PhSPY有82%的同源性，与拟南芥的SPY有81%的同源性，与大麦的HvSPY有74%的同源性。SsSPY的TPR结构与拟南芥、矮牵牛和西红柿等植物的SPY基因相似性较高(图4)。因此，把该基因命名为SsSPY，GenBank登录号为ACF96937。

图3 大岩桐SsSPY基因序列和推测的氨基酸序列 注: ATG: 起始密码子; TAG: 终止密码子; 方框分别表示加尾信号和poly(A)15 Figure 3 Sequence of Sinningia speciosa's SsSPY and its deduced amino acid sequence Note: ATG: Start codon; TAG: Stop codon; The boxes indicated signals of adding poly A tail and poly(A)15 tail respectively

图4 SsSPY及其同源蛋白的多序列比对 Figure 4 Multiple secquence alignment of SsSPY and its homologous proteins

利用MEGA 3.1软件构建SPY系统发育树(图5)，可以发现SsSPY与巨桉的EgSPY同源性较高。

图5 SsSPY与几种植物SPY蛋白的进化树分析 注: 系统发育树分析及多序列比对所涉及的有关基因序列如下: 番茄的LeSPY (Q8RVB2); 矮牵牛的PhSPY (O82039); 大岩桐的SsSPY (ACF96937); 巨桉的EgSPY (Q8LP10); 拟南芥的AtSPY (NP_187761); 水稻的OsSPY (NP_001062501); 早园竹的PpSPY (AAY32335); 大麦的HvSPY (O82422); 绿藻的OtSPY (CAL57394) Figure 5 Phylogenetic analysis of SsSPY and several plant SPY proteins Note: The members of SPY homologous genes listed in the tree are as follows: LeSPY (Q8RVB2) from Lycopersicon esculentum; PhSPY (O82039) from Petunia x hybrid; SsSPY (ACF96937) from Sinningia speciosa; EgSPY (Q8LP10) from Eustoma grandiflorum; AtSPY (NP_187761) from Arabidopsis thaliana; OsSPY (NP_001062501) from Oryza sativa; PpSPY (AAY32335) from Phyllostachys praecox; HvSPY (O82422) from Hordeum vulgare; OtSPY (CAL57394) from Ostreococcus tauri

1.2 SsSPY基因的器官特异性表达分析
在选取的六种器官中都得到了一条3 000 bp左右的条带，且条带亮度比较一致，说明SsSPY基因几乎在大岩桐的所有部位都表达，且表达的量基本相同(图6)。

图6 大岩桐SsSPY基因在各器官表达的RT-PCR分析 注: 1: 根; 2: 茎; 3: 叶; 4: 开放的花; 5: 直径14 mm花芽; 6: 直径7 mm花芽 Figure 6 Organ-specific expression of the SsSPY gene by RT-PCR analysis in Sinningia speciosa Note: 1: Roots; 2: Stems; 3: Leaves; 4: Opening flowers; 5: Flower buds of 14 mm diameter; 6: Flower buds of 7 mm diameter

1.3转SsSPY基因烟草的表型分析
通过农杆菌介导将SsSPY转化烟草，对移栽成活的17株转基因烟草植株进行了SsSPY表达的RT-PCR检测。结果显示，在17株转基因植株中，有14株在叶片中检测到SsSPY的强表达，转化效率高达82.4%，在野生型植株中未检测到SsSPY的表达，表明SsSPY整合到烟草基因组中，并成功表达(图7)。

图7 SsSPY转化烟草的RT-PCR检测 注: 1~17: SsSPY转基因植株; 18: 野生型植株 Figure 7 RT-PCR analysis of SsSPY transformed tobacoo Note: 1~17: SsSPY transfomed plants; 18: Wild type

转基因烟草苗移栽90 d后观察记录其表型变化，发现转基因烟草表现出两类差异显著的表型。第一类表型的转基因植株在株高、节间长、花芽数等方面与野生型没有明显区别；而第二类表型的转基因烟草与野生型相比，株高、花芽数、分枝数均显著增加，节间增长(表1; 图8)。

表1 SsSPY基因转化烟草的表型变化* Table 1 Phenotype variations of SsSPY transformed tobacoo*

图8 SsSPY基因转化烟草植株的表型变化 注: A: 野生型(左)和第Ⅱ类转基因植株(右); B: 第Ⅱ类转基因植株的上端部分(显示有更多的花芽和分枝); C: 野生型植株的上端部分 Figure 8 Phenotype vaiations of SsSPY transformed tobacoo Note: A: Wildtype plant (left) and typeⅡ transgenic plant (right); B: Upper part of typeⅡ transgenic plant (show more floral buds and branches); C: Upper part of wildtype plant

2讨论
SsSPY转化烟草植株除一部分与野生型没有明显差异之外，有差异的表型与预期的结果相去甚远，表现为GA反应增强的生长变化。作为赤霉素信号转导的负调控因子，SsSPY的过量表达在理论上应该表现为GA缺失的表型，如将35S:SPY转化矮牵牛，结果与野生型相比，转基因植物株型矮化、节间变短，花期延迟6~7个星期，且花芽大都停留在发育的第二阶段(Izhaki et al., 2001)。但也有一些研究结果与我们所观察到的现象较一致，Swain等(2001)将35S:SPY转入拟南芥中，结果发现35S:SPY转化植株的下胚轴更长，莲座叶更大，提早开花。Swain等(2001)对此提出了两种解释：一是由于SPY蛋白过量表达会与其它蛋白(如GA信号转导中起负调节作用的RGA蛋白、GAI蛋白)反应，形成复合体，从而使这些蛋白失活；二是SPY蛋白过量表达会出现不适当的O-GlcNAc靶蛋白修饰，从而活化了GA的反应。

第Ⅱ类转基因烟草植株的分枝明显增多，这可能由于SPY还作为正调节子参与细胞分裂素的信号转导有关(Greenboim-Wainberg et al., 2005)，由于SPY蛋白的过量表达，会促进细胞分裂素的反应，而削弱顶端优势，进而促进分枝。Steiner等(2012)进一步证实SPY基因与Ⅰ型TCP基因(TCP14和TCP-15)相互作用，在叶和花中促进细胞分裂素的反应。

3材料与方法
3.1材料及其RNA的提取和逆转录
大岩桐(Sinningia speciosa)试管苗移栽3个月后，称取100 mg幼嫩叶片。采用异硫氰酸胍法(GT)提取叶组织的总RNA，取2 μg的总RNA，用反转录试剂盒(RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA，然后进行RACE及RT-PCR等试验。

3.2大岩桐SsSPY基因的克隆
比对矮牵牛、拟南芥、番茄、大麦、水稻等植物SPY同源基因的mRNA序列，在其保守区域设计两对引物(上海生工公司合成, SsSPY01: 5'-TGCTTTCCACTTCAATCCTC-3'; SsSPY02: 5'-GTTGTGTTAGGGTATCCAATCCA-3'; SsSPY03: 5'-TTCAGGGTAAAATGGATGCTGCT-3'; SsSPY04: 5'-TAGGGTAGCCAATCCAAGTCACCTG-3')。以叶片的cDNA为模板进行第一轮PCR扩增(引物为SsSPY01和SsSPY02)，第一轮PCR的条件为94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环；72℃ 10 min。以第一轮PCR的产物为模板，进行第二轮PCR扩增(引物为SsSPY03和SsSPY04)，第二轮PCR的条件与第一轮PCR的相同。经二轮PCR后获得中间片段序列，将回收得到的中间片段连接到pMD18-T载体上，然后送公司测序。

根据已获得的中间片段序列，设计两个5'端巢式引物，与TAKARA公司的5'-Full RACE Kit所带引物形成嵌套，以第一链cDNA为模板，进行3' RACE, 将回收的PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上，送公司测序。两个5'端巢式引物为：SsSPY05 (Outer): 5'-GCAATTGAAGCAACGAGCA-3'，SsSPY06 (Inner): 5'-CATACGAGCAGTGCCTCAAA-3'，试剂盒引物为：3RACE (Outer)：5'-TACCGTCGTTCC- ACTAGTGATTT-3'，3RACE (Inner)：5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'。

根据已获得的中间片段序列，设计两个3'端巢式引物，与TAKARA公司的5'-Full RACE Kit所带引物形成嵌套。以第一链cDNA为模板，进行5'RACE，将回收的PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上，送公司测序。两个3'端巢式引物为：SsSPY07 (Outer)：5'-TGGGGAAATAACCGCATAAA-3'，SsSPY08 (Inner)：5'-TAACCGCATAAACCGCCTAC-3'。试剂盒引物为：5RACE (Outer)：5'-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3'；5RACE(Inner)：5'-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3'。

利用DNAMAN软件，拼接以上所得到的中间、3'端和5'端序列，拼接出全长序列后，在拼接的全长序列两端设计全长基因的特异性引物(SsSPY09: 5'- TTTGTATTTAGTTATATGGCGTCGC-3'; SsSPY10: 5'-TCAACTCAACTCGGCTGAATTACT-3')，使用TaKaRa长片段Tag酶(LA Tag酶)进行PCR扩增，将回收的PCR扩增产物连接到pMD18-T载体上，送公司测序。

3.3 SsSPY基因序列的生物信息学分析
在NCBI网页上，以Blastn比对SsSPY基因的核苷酸序列，以Blastp比对SsSPY基因的氨基酸序列；使用DANman 4.0进行氨基酸序列比对分析；使用MEGA 3.1进行进化树分析。

3.4 SsSPY器官特异性表达分析
分别提取大岩桐的根、茎、叶、花芽(直径分别为7 cm和14 cm)的总RNA，反转录后得到不同组织的cDNA，以肌动蛋白(Actin)作为内标对所有cDNA模板进行半定量，对不同反转录产物进行RT-PCR特异性扩增，确定SsSPY在不同组织中的表达量。PCR条件为94℃ 3 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，35个循环后；72℃ 10 min，RT-PCR的引物用全长引物；Actin的引物为ActinF：5'-GGGAAGATCTGGCATCACA-3'，ActinR：5'-CCTCCAATAAAGACACTGTA-3'。

3.5 SsSPY的载体构建及烟草转化
用SmaⅠ和SacⅠ双酶切pMD18-T载体(含SsSPY基因)，得到SsSPY基因片段；SmaⅠ和SacⅠ双酶切pBI121，得到载体片段，连接SsSPY基因片段和pBI121载体片段，获得pBI121-SsSPY表达载体。将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue，提取质粒后经PCR及酶切反应双重验证，均获得3 000 bp片段，说明表达载体构建成功后，用于转化。

电击法将pBI121-SsSPY导入根癌农杆菌GV3- 101。用叶盘法转化‘黄苗鱼’烟草，在MS+1.0 mg/L BA+50 mg/L Km+300 mg/L Cef培养基上筛选幼苗。以转基因的烟草基因组DNA和野生型基因组DNA为模板，用SsSPY特异性引物(5'-CCCCGGGTTTGTATTTAGTTATATGGCGTCGC-3'; 5'-CGAGCTCTCAACTCAACTCGGCTGAATTACT-3')进行PCR检测。经检测转基因阳性的幼苗移栽到花盆中，栽培基质为泥炭:珍珠岩=3:1，在白天24℃，12 h，晚上18℃，12 h的人工气候室中培养。培养40 d后，以叶片为材料，对22株烟草进行SsSPY的RT-PCR分析。移栽90 d后，统计株高、节间长、花芽数和分枝数。

作者贡献
钟丹、姜仕豪是本研究的实验设计和实验研究的执行人；胡立霞完成数据分析，论文初稿的写作；陈敏参与实验设计，试验结果分析；庞基良是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31071818)和浙江省重点科技创新团队项目(2010R50039)共同资助。

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