香蕉(Musa spp.)是世界著名的热带亚热带水果，也是仅次于水稻、小麦和玉米的第四大粮食作物。因此，香蕉生产攸关世界粮食安全、地区发展和人类健康。中国香蕉产业经过近50年来的持续发展，至2010年中国香蕉生产面积达4.138×105 hm2，总产量为9.848 9×109 kg (FAO, 2012, http://faostat.fao.org/site/339/default.aspx)。

目前，香蕉生产受到尖孢镰刀菌古巴专化型(Foc)侵染引起的世界性的毁灭性病害——香蕉枯萎病，此病不仅在中国各香蕉主产区如广东、海南、广西等大面积爆发和流行，而且在世界其他各大香蕉产区也大规模地发生。香蕉枯萎病给中国乃至世界香蕉生产造成巨大的经济损失，严重制约香蕉产业稳定发展，迫切需要解决(Ploetz, 2006; 黄秉智等, 2012, 广东农业科学, 39(5): 12-14, 26)。深入研究香蕉抗枯萎病抗性机理，进行抗病品种选育和寻求有效的防治措施是目前研究的重点。

植物受到病原菌侵染后可能被诱导发生组织结构上的变化，以遏制病原物的接触、侵入或抑制病原物的繁殖和输导，从而产生植物抗病性(刁毅, 2006)。植物本身的这些结构屏障，包括如细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素等等。研究证实，棉花、大豆、番茄和西瓜等抗、感病不同的品种其组织结构和侵染后的反应不完全相同(袁红旭和商鸿生, 2002; 马青等, 2004; 苗琛等, 2004; 李海燕等, 2005; 台莲梅等, 2006)。但是，关于香蕉枯萎病的组织结构抗病机理，目前国内外研究的都较为缺乏和片面。Li等(2011)和殷晓敏等(2011)利用绿色荧光蛋白标记的香蕉枯萎病菌4号生理小种(GFP-Foc4)，接种香蕉根系直接清晰的观察病原菌在香蕉根系的侵染和扩展过程。李赤等(2011)使用香蕉枯萎病菌4号小种粗毒素和纯品镰刀菌酸对新北蕉和巴西蕉幼苗叶片进行处理, 观察叶片超微结构发生的变化，但是该研究采用的是毒素处理和离体培养的方法，未能最真实的反应枯萎病原菌侵染下香蕉植株的组织抗性。

本研究在砂培条件下采用不同抗病性香蕉植株，在枯萎病菌浸染后观察其球茎细胞超微结构变化，探讨细胞结构变化与抗病性的关系，可为香蕉枯萎病防控和抗病基因工程育种提供重要的理论基础。

1结果与分析
1.1枯萎病菌对感病香蕉的侵染状况
在感病品种巴西香蕉中，接种带GFP荧光标记的枯萎病原菌热带4号小种(Foc TR4)后，利用激光共聚焦电镜观察，3 d后有大量孢子吸附到巴西根系上，6 d后大量孢子已萌发成芽管，有些长成菌丝体，遍布根系细胞壁间隙并侵入细胞内部(图1A; 图1B)。接种5 d后部分菌丝已经从根系向上入侵球茎中，第10天观察到大量菌丝集聚在球茎的维管木质部和韧皮部处(图1C; 图1D)。

香蕉枯萎病原菌侵入巴西香蕉幼根或根部损伤部位后，迅速在根系内定殖并萌发，从根部感病，逐渐向上侵染到球茎，扩散至假茎，图2所示为Foc TR4侵染两周后的巴西香蕉根系和球茎部状况，清水对照中巴西香蕉根系和颈部正常良好发育，Foc TR4侵染两周后根部变成红棕色，球茎维管束有黄到褐色病变(图2A; 图2B)。

图1 枯萎病原菌热带4号小种侵染巴西香蕉根与球茎 Figure 1 Root and pseudostem of the susceptible BAXI Cavendish (Musa AAA) infected by Foc TR4-GFP

图2 Foc TR4侵染两周后巴西香蕉根系和球茎外部特征观察 Figure 2 The external characteristics of root and pseudostem infected with Foc TR4 in susceptible BAXI Cavendish (Musa AAA) at 2 weeks after inoculation

1.2枯萎病菌对抗感病香蕉品种的侵染过程及病理组织学变化
清水对照处理的巴西蕉苗球茎的超微结构，其细胞排列整齐，细胞壁光滑、完整无损，维管组织发育良好(图3A1)；细胞内含有大量的细胞器；核仁核膜清晰完整，细胞质均匀，质壁光滑；高尔基体匀称完整；线粒体膜清晰、完整，内脊结构完好(图3B1; 图3C1)。

经枯萎病原菌热带4号小种处理一周后，巴西蕉球茎的超微结构发生了明显变化：细胞壁断裂溶解，出现严重的质壁分离现象(图3A2; 图3B2)；高尔基体肿胀，排列疏松，结构开始逐渐分解(图3C2)；线粒体出现变形，膜开始破裂，脊明显减少；内脊结构不清晰，内含物外流胞超微结构受到的破坏逐渐严重(图3D)。大量枯萎病原菌孢子聚集于细胞壁间隙，萌发成菌丝破壁入侵细胞质内，细胞壁断裂并形成空洞(图3E; 图3F)。

图3 巴西香蕉在Foc TR4侵染处理与清水对照中的球茎组织超微结构 Figure 3 Tissue ultrastructure of the control and Foc TR4-treated pseudostem of Baxi banana (Musa AAA)

对照无侵染的抗病品种抗枯5号的超微结构如图4A1、图4B1和图4C1所示。从图中可以看出，抗病品种球茎的超微结构与感病品种基本相似，包括细胞排列、线粒体膜和内部结构、核仁核膜、细胞壁和细胞膜等。但也有明显不同的地方：细胞壁的明显比感病品种厚，并且细胞质中存在较多淀粉粒(图4A1)。

经枯萎病原菌4号小种处理后，抗枯5号香蕉球茎的超微结构变化明显不大，破坏程度远比感病品种轻：细胞排列较整齐，细胞壁完整基本无损，维管组织发育良好，内质均匀(图4A2)；细胞器包括线粒体、高尔基体和内质网丰富并且完整；轻微质壁分离；线粒体仅发生稍微变形，膜稍有损坏，内部结构较清晰清晰可见(图4B2; 图4C2)；细胞壁有加厚并木栓化，可见褐色物质侵填(图4D)；在抗病品种中出现乳突结构，即细胞壁延伸凸起，形成乳突状结构，将孢子和菌丝包裹其中，使孢子延迟萌发(图4E)。

图4 抗枯5号香蕉在Foc TR4侵染处理与清水对照中的球茎组织超微结构 Figure 4 Tissue ultrastructure of the control and Foc TR4-treated pseudostem of Kangku 5 (Musa AAA)

1.3枯萎病菌对抗感病粉蕉品种的侵染过程及病理组织学变化
在清水对照处理中，与巴西蕉苗球茎的超微结构基本相似，广粉1号和纷杂1号粉蕉中包括细胞排列、线粒体膜和内部结构、核仁核膜、细胞壁和细胞膜等都比较正常完整，维管组织发育良好，内质均匀，其中粉杂1号粉蕉细胞壁较厚(图5A1, 图5B1, 图5C1和图6A1, 图6B1, 图6C1)。经枯萎病原菌1号小种侵染后一周，广粉1号粉蕉的球茎超微结构发生明显变化，与感病巴西香蕉品种相似并较之严重：细胞壁严重断裂并溶解破环，质壁分离严重(图5A2; 图5C2)；维管组织堵塞，产生褐色物质沉积(图5B2箭头处) ；细胞质膜结构完全破损，内容物外流，细胞器破损已无完整结构(图5C2)。在抗病粉蕉品种粉杂1号中则与抗病香蕉GCTV-119相似，侵染后超微结构破坏程度较感病品种低，其细胞壁完整，细胞器丰富，膜稍损变形(图6A2; 图6B2)除了同样出现褐色侵填物质外，并无发现相似的乳突结构(图6A2; 图6C2)。

图5 广粉一号粉蕉在FOC侵染处理与清水对照中的球茎组织超微结构 Figure 5 Tissue ultrastructure of the control and Foc TR4-treated pseudostem of Guangfen 1 (Musa ABB)

图6 粉杂一号粉蕉在FOC侵染处理与清水对照中的球茎组织超微结构 Figure 6 Tissue ultrastructure of the control and Foc TR4-treated pseudostem of Fenza 1 (Musa ABB)

2讨论
香蕉镰刀菌枯萎病原菌由香蕉幼根或根部损伤部位侵入根茎、假茎，破坏香蕉维管束细胞，导致蕉株枯萎死亡。关于枯萎病原菌对香蕉的致病作用，尤其是其分泌的毒素对香蕉组织的损坏已经有很多报道。

Drysdale (1984)证明了香蕉枯萎病菌分泌非专化性毒素—镰刀菌酸。李春雨等(2011)利用高效液相色谱—电喷雾离子阱质谱(HPLC-ESI-MS)及1H-NMR法对所分离的28个FOC菌株的次生代谢产物进行分析。发现了分子量为179 kD的镰刀菌酸及分子量约为783 kD的白僵菌素。离体试验表明这两种毒素均可导致香蕉假茎腐烂。

在病菌侵入寄主后，镰刀菌酸可能破坏根系的膜系统，造成代谢紊乱，抑制了根细胞养分和水分的吸收和运输；还可能导致病株可产生胶状物，而胶状物可能会堵塞香蕉导管的营养和水分运输，使病株萎蔫(许文耀等, 2004)；毒素能破坏细胞核和核糖体的结构，抑制DNA指导下的RNA的合成;使细胞发生质壁分离、原生质体颗粒化、线粒体肿大、双膜崩解等(魏松红等, 1999)。本研究结果表明，枯萎病原菌热带4号小种侵染处理下，抗感病品种球茎均发生质壁分离；感病品种巴西香蕉和广粉粉蕉的球茎细胞壁破损断裂，细胞器与膜系统受损严重；抗病品种抗枯5号香蕉和粉杂粉蕉细胞器膜受损较轻，内部结构基本无破损，与李赤等(2011)研究结果比较相符合。原因之一可能是香蕉受到枯萎病原菌侵染后，产生并分泌毒素(如镰刀菌酸和白僵菌素)以影响球茎细胞的超微结构，这与前人的研究的毒素理论是相符的。另外也可能是枯萎病原菌侵染至香蕉根系和球茎，分泌产生细胞壁溶解酶等，使细胞结构破损。

植物组织结构屏障，如细胞壁的角质、蜡质、栓质、木质素、胼胝体、胶滞体、侵填体、周皮、乳突、晕圈等的形成以遏制病原物的接触、入侵或抑制病原物的繁殖和输导，使植物表现出一定的抗病性(刁毅, 2006)。抗、感病不同的品种其组织结构和侵染后的反应不完全相同，在本研究中枯萎病原菌侵染处理下，球茎木质部导管中相继出现侵填体及一些灰褐色物质，抗病品种抗枯5号香蕉和粉杂粉蕉维管细胞壁加厚，皮层薄壁细胞壁木质化，在抗枯5号香蕉品种中出现乳突的抗病特征。抗病品种的这些组织结构抗性因子间相互结合，以产生多种结构变化协同作用于病原菌，阻碍了病原菌的进一步入侵及输导。木质化作用即木质素加厚细胞壁，使细胞壁的韧度增强以抵抗真菌酶的降解，可限制真菌酶和毒素向寄主的扩散，阻止营养与水份的自由流动；可钝化真菌的生长点, 限制真菌的生长。乳突是在寄主细胞壁内表面形成的碳水化合物和纤维素的外层呈圆顶形的积累层。植物产生乳突结构可以有效延缓病菌侵入寄主细胞内部，使形成坏死反应(胡东维等, 1997)；乳突中含有水解酶、酚类物质、蛋白质、多糖、木质素、硅、Ca²⁺和软木脂等成分，也加强了病原物的抗性(张晓燕等, 2002)。植物维管束细胞的细胞壁向木质部突出、进入导管后形成的特殊结构就是侵填体，可阻止病菌的扩散与传播。

在本研究中，抗病香蕉品种尽管出现如乳突、木质化、产生侵填体等结构抗性，但是其作用仅延缓或阻遏病原菌的入侵及输导，并不能彻底使植株避免病原菌的侵染。抗枯5号香蕉与粉杂1号粉蕉在田间表现有较高的抗病性。因此，香蕉组织结构抗性很可能与其他抗性如生理生化抗性等相互作用,以协同抵御枯萎病原菌。在下一步研究中，一方面继续深入研究香蕉组织结构抗性的分子机理；另一方面重点研究香蕉抗性的生化基础与分子机制。以期更好的了解香蕉与枯萎病菌相互作用和香蕉抗性机理，为指导香蕉抗病育种和防控枯萎病提供理论基础。

3材料与方法
3.1供试材料
供试香蕉品种为抗枯5号香蕉(Musa AAA, 抗病)和巴西香蕉(Musa AAA, 感病)，粉杂1号粉蕉(Musa ABB,抗病)，广粉1号粉蕉(Musa AAA, 感病)，香蕉组培苗由广东省农业科学院果树研究所香蕉组培中心提供。

3.2供试菌种
尖孢镰刀菌香蕉专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)分离于广东东莞市红梅镇的香蕉和粉蕉枯萎病病株。香蕉枯萎病原菌1号和4号小种的分离、纯化、培养及孢子悬浮液的制备参照王拱辰等(王拱辰等, 1996, 中国农业科技出版社, pp.63-64)和Li等(2011)的方法。经转化的带GFP荧光标记病原菌(GFP-Foc TR4)用于接种感病巴西香蕉苗以观察病原菌侵染情况，其转化及制备参见Li等(2011)。

3.3试验方法
供试品种组培苗经仔细清洗根部的培养基后种植于灭菌的石英砂中，培养箱条件为26℃~28℃，16 h光照，8 h黑暗培养。隔天喷施Hogland配方施营养液(pH 5.8)，成分为Ca(NO₃)₂•4H₂O 945 mg/L，KNO₃ 607 mg/L，NH₄H₂PO₄ 115 mg/L，MgSO₄•7H₂O 493 mg/L，微量元素为：NaFe₂ EDTA 30 mg/L，H₃BO₃ 2.86 mg/L，MnSO₄•7H₂O 2.13 mg/L，ZnSO₄•7H₂O 0.22 mg/L，CuSO₄•5H₂O 0.08 mg/L，(NH₄)₆M_o7O₂•4H₂O 0.02 mg/L。待幼苗恢复2周后，长至4~5片叶时，供作试验用。
在侵染观察试验中，转化的GFP-Foc TR4培养后，分别用PDA液体培养基将孢子洗脱下来，然后用纱布过滤后终浓度调整至1×106个孢子/毫升。取4~5叶巴西组培苗，伤根浸泡接种10 min，种植于石英砂中，于第3天和第6天收集蕉苗根部，并于第5天和第10天采集球茎部，手动切成薄片置于激光共聚焦显微镜下观察孢子侵染情况，两周后取香蕉植株，纵向剖开以观察球茎与根系的侵染情况。

在超微结构观察试验中，小心取出蕉苗将根系浸泡在1×106个孢子/毫升的悬浮液中浸根10 min (抗枯5号香蕉和巴西香蕉用4号小种，粉杂1号粉蕉和广粉1号粉蕉用1号小种)，浸没深度1 cm左右，对照组以蒸馏水代替孢子悬浮液，再种植于石英砂中。于接种后第7天采样观察。采样时清水洗净根部沙粒，再用蒸馏水冲洗2次，将切取的1 mm大小的球茎部材料放入2.5%戊二醛、2%多甲醛和0.1 mol/L二甲砷酸钠中进行前固定，pH 7.2 0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲溶液冲洗，1%锇酸后固定,梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，在透射电镜(JEM1010)下观察细胞结构的变化以及病原菌的侵染状况。

作者贡献
邝瑞彬和李春雨是本研究的实验设计和实验研究的执行人；杨静参与病原菌及香蕉植株的准备及侵染实验；邝瑞彬完成数据分析，论文初稿的写作；魏岳荣、杨乔松、盛鸥和胡春华参与实验及实验结果分析；易干军是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都已阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由NCSF-广东联合基金(U1131004)、广东省自然科学基金项目(10451064001006121)、广东省农业科学院院长基金(201013)和公益性行业(农业)科技专项(200903049-10)共同资助。作者感谢中国科学院华南植物园公共实验室徐信兰主任和邓汝芳老师对超薄切片的制作及电镜观察提供了技术指导。

参考文献
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