乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase, ACCase)是脂肪酸合成的关键酶。在植物中乙酰辅酶A羧化酶主要有异质型(ACCaseⅡ)和同质型(ACCaseⅠ)两种。ACCaseⅡ由生物素羧基载体蛋白亚基(Biotin carboxyl carrier protein, BCCP)、生物素羧化酶(Biotincarboxylase, BC)亚基、以及羧基转移酶的α-CT亚基和β-CT亚基等4种亚基组成。除β-CT亚基由质体基因编码外，其它亚基都是由核基因编码，在细胞质中合成后转运到质体中组成功能蛋白，参与脂肪酸的合成(Kozaki et al., 2001)。ACCaseⅡ是植物种子脂肪酸合成的关键酶，与种子含油量密切相关(Slabas and Fawcett, 1992; Post-Beittenmiller et al., 1992; Roesler et al., 1997; Focks and Benning, 1998; Thelen and Ohlrogge, 2002)。

目前，已从拟南芥(Thelen and Ohlrogge, 2002)、甘蓝型油菜(戴晓峰, 2007)等植物中克隆出BCCP亚基基因。云南小油菜为野生白菜型油菜，种质资源丰富，具有许多特种基因资源可用于油菜遗传育种，如高含油量、特早熟、抗旱、抗蚜虫等(何婷婷等, 2010)。本研究以云南小油菜(Brassica campestris)为材料，克隆出BCCP亚基基因，并进行了生物信息学分析，为油菜高含油量的分子机理解析及高含油量转基因育种提供依据。

1结果与分析
1.1云南小油菜BCCP基因的克隆
取云南小油菜29号的叶子，利用CTAB法提取总DNA。用特异引物BnBp4-1/BnBp4-2进行PCR扩增，扩增出目标片段，大小约为1 667 bp (图1)。对扩增的目标片段进行回收、纯化、克隆和测序，获得了云南小油菜BCCP基因的核苷酸序列。

图1 云南小油菜BCCP基因的PCR扩增 Figure 1 Amplifying BCCP gene from Yunnan xiao rapeseed DNA

1.2云南小油菜BCCP基因的ORF分析
利用Vector NTI软件对云南小油菜BCCP基因的序列进行分析，发现该基因有5个内含子，内含子1从229 bp至495 bp，为263 bp，内含子2从534 bp至635 bp，为93 bp，内含子3从755 bp至842 bp，为88 bp，内含子4从1165 bp至1252 bp，为88 bp，内含子5从1 325 bp至1 404 bp，为80 bp。将其ORF与NCBI公布的甘蓝型油菜Bp4基因的mRNA进行Blast比对，发现它存在碱基替换、插入和缺失，特别是在ORF序列747 bp后，即基因序列中的1 598 bp后碱基变化比较大，出现6个碱基插入和3个碱基的替换，比Bp4多了两个氨基酸(图2)。

图2 云南小油菜BCCP基因与Bp4的序列比对 Figure 2 Sequence alignment between BCCP gene from Yunnan Xiao rapeseed and Bp4

1.3云南小油菜BCCP亚基的氨基酸序列分析
对云南小油菜BCCP亚基与甘蓝型油菜Bp4蛋白进行氨基酸序列比对，结果表明(图3; 表1; 表2)，云南小油菜BCCP亚基有258个氨基酸，在第138氨基酸后有30个位点发生了氨基酸改变，但都处于非功能域之中。云南小油菜BCCP亚基有4个功能保守区，即第1至18位、44至75位、89至118位、188至249位。第1功能保守区为信号肽，具有信号肽的基本特征，即①含有较多的碱性氨基酸，即有2个精氨酸(R)，2个脯氨酸(P)；②具有较多的疏水性氨基酸，即有3个丙氨酸(A)、2个缬氨酸(V)、1个亮氨酸(L)和１个异亮氨酸(I)；③不含酸性氨基酸。pH=7时，其电荷为+2.19。第2功能保守区包含32个氨基酸，极性氨基酸含量最高。第3功能保守区由30个氨基酸组成，富含疏水氨基酸，即有13个疏水氨基酸，能形成疏水面，是亚基相互结合的位点。第4功能保守区酸性最强，由62个氨基酸组成，富含脯氨酸、甘氨酸，其中保守基序AMKLMN是生物素化位点(Thelen et al., 2000)，是BCCP亚基的核心功能域。可见，作者克隆的云南小油菜BCCP亚基基因是有功能的。为了验证该克隆基因是表达的并有功能，我们从云南小油菜的叶片、早期角果、中期角果、晚期角果提取RNA，并根据克隆基因的外显子设计引物进行RT-PCR检测，扩增出了目标带(图4)，说明该基因在叶片、角果中都有表达，并且在角果中表达水平较高。

图3 云南小油菜BCCP亚基与Bp4的氨基酸序列比对 Figure 3 Amino acids sequence alignment between BCCP subunit from Yunnan xiao rapeseed and Bp4

表1 云南小油菜BCCP亚基与Bp4的氨基酸改变 Table 1 Changes of amino acid of BCCP subunit from Yunnan xiao rapeseed based on Bp4

表2 YnsrBCCP蛋白的保守区序列特征与生化特性 Table 2 Sequence characterization and biochemical characters of the conservative domains in ynsrBCCP

图4 云南小油菜BCCP基因的RT-PCR扩增 Figure 4 RT-PCR amplifying of BCCP gene from Yunnan Xiao rapeseed

1.4云南小油菜BCCP基因与其他植物BCCP基因的同源性分析
将云南小油菜BCCP基因(ynsrBCCP)的ORF与NCBI上公布的其他植物的BCCP基因的mRNA进行同源性分析(图5)，发现云南小油菜BCCP基因与甘蓝型油菜Bp4的同源性最高，高达95%，与甘蓝型油菜Bp6的同源性也高达91.5%，而与拟南芥的同源性只有49%。

图5 BCCP基因同源性分析 Figure 4 Homology analysis of BCCP gene

2讨论
戴晓峰等(2007)从甘蓝型油菜中克隆出生物素羧基载体蛋白(BCCP基因)均含5个内含子，且全长均为1 600 bp左右，但其中BCCP1基因编码的蛋白质具备完整的生物素化功能结构域，是唯一功能完整编码的基因，而BCCP2和BCCP3则由于移码突变造成蛋白合成提前终止，翻译的蛋白质均缺少生物素化结构域。本研究云南小油菜BCCP基因长为1 600 bp以上，含有6个外显子，编码258个氨基酸，有四个功能保守区，其中第四功能保守区的保守基序AMKLMN是生物素化位点(Thelen et al., 2000)，是BCCP亚基的核心功能域，说明我们克隆的基因是功能基因。该基因的克隆为油菜的基因研究，以及该基因与含油量关系的研究提供了条件。

云南小油菜BCCP亚基与甘蓝型油菜Bp4的氨基酸序列相比较，有30个氨基酸发生变化，或被替换、或被插入或被缺失，但发生在非功能保守区中。云南小油菜BCCP基因的ORF与甘蓝型油菜Bp4 mRNA的同源性高达96%。迄今，已有许多研究证明甘蓝型油菜BCCP基因是一个多基因家族，存在功能基因和假基因。对于云南小油菜BCCP基因是否是多基因家族，这些基因与种子中脂肪酸合成的关系怎样，还有待于进一步研究。

3材料与方法
3.1材料
云南小油菜29号(Brassica campestris) (含油量达49.26%)，由云南农业大学油料作物研究室提供。

PCR试剂购于TaKaRa生物公司，包括Ex Taq酶，Taq酶10×Buffer，dNTPs等；PUCm-T Vector购于TaKaRa生物公司；T4连接酶及Buffer购于Fermentas生物公司。

3.2云南小油菜基因组DNA的提取
总DNA的提取采用CTAB法，具体步骤如下：取0.3 g鲜叶放入1.5 mL离心管，加600 μL 2% CTAB，65℃水浴1.5 h，取出待降至室温后加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，上下颠倒混匀5 min，13 000 rpm离心10 min，取上清；于另一1.5 mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，轻摇5 min，1 3000 rpm离心10 min。取1.5 ml离心管，小心移取上清于离心管中，加等体积异丙醇，混合5 min，-20℃，沉淀1 h以上，13 000 rpm离心10 min。加1 mL 70%乙醇洗沉淀。4 000 rpm，离心10 min，弃上清，晾干。加50 μL ddH₂O溶解DNA。1%琼脂糖胶在紫外下检测DNA质量。

3.3引物设计与PCR扩增
根据NCBI上公布的甘蓝型油菜(Brassica napus L) Bp4基因的序列，利用primer5软件设计引物并送上海生工合成。引物BnBp4-1为5’-ATGGCGTCATTGTCTGTACCT-3’，引物BnBp4-2为5’-TCAAGGCACGATGGTAAACA-3’。

PCR反应体系如下：3 μL 10×Ex Taq Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，2 μL Primer 1，2 μL Primer 2，1 μL Template，20 μL H₂O，0.25 μL Ex Taq，总体系为30 μL。PCR反应程序如下：95℃预变性5 min，94℃变性50 s，61℃退火50 s，72℃延伸2 min，72℃终延伸10 min，38个循环。1%的琼脂糖凝胶电泳。

3.4目的DNA片段的克隆、测序
目的片段采用TaKaRa公司的胶回收试剂盒进行回收纯化，并取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

取pMD18-T vector 1 μL、目的DNA片段10 μL、T4连接酶1 μL、连接Buffer 2 μL，16℃连接12~16 h。然后将连接产物热激法转化到大肠杆菌感受态细胞中，并涂布在含有Amp、x-gal、IPTG的LB培养基上培养，形成单菌落。挑白色单菌落，做菌落PCR鉴定。提取阳性克隆的质粒，送上海生工进行正、反向测序。

3.5生物信息学分析
碱基序列、氨基酸序列比对采用DNAman、DNAstar、NCBI blast软件分析，同源性分析采用clustalx、MEGA4.0软件分析。

3.6 RT-PCR检测
采用水饱和酚法提取云南小油菜叶片和角果的RNA，并纯化除去DNA污染。然后利用TaKaRa公司的反转录试剂盒进行反转录获得cDNA，最后以所得的cDNA为模板进行PCR检测。根据克隆基因的ORF设计PCR引物并送上海生工合成，引物1为5’-ACGTGAAGAGCAATGTTCCTGA-3’，包含外显子1的3’端序列和外显子2的5’端序列，引物2为5’-CTCCAGTCTCGTGTCAACGCTA-3’，扩增目标片段大小为539 bp。PCR反应体系如下：2 μL 10×PCR Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTP，Primer各1 μL，1 μL cDNA，0.25 μL Taq酶，ddH₂O 12.75 μL，总体系为20 μL。PCR扩增程序为95℃预变性5 min，94℃变性50 s，60℃退火50 s，72℃延伸80 s，共38个循环，72℃终延伸10 min。然后用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

作者贡献
龚莹是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作，彭少丹，陈升位，王学军参与实验设计与实验数据分析，官春云教授和林良斌教授是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究国家支撑计划(2011BAD35B04)和国家863计划(2011AA10A104)共同资助。

参考文献
Dai X.F., Lu C.M., Wu G., Wu Y.H., and Xiao L., 2007, Gene cloning and structural analysis of biotin carboxyl carrier protein encoding gene in Brassica napus, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 40(9): 1883-1889 (戴晓峰, 卢长明, 吴刚, 武玉花, 肖玲, 2007, 甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白基因的克隆与结构分析, 中国农业科学, 40(9): 1883-1889)

Focks N., and Benning C., 1998, Wrinkled1: a novel, low-seed-oil mutant of Arabidopsis with a deficiency in the seed-specific regulation of carbohydrate metabolism, Plant Physiol., 118(1): 91-101

He T.T., Ma Z.Q., Peng S.D., Xia G.Y., Lin L.B., and Xu X.G., 2010, Collection and evaluation agronomic traits of Yunnan wild rape, Zhongzi (Seed), 29(7): 64-67 (何婷婷, 马忠琴, 彭少丹, 夏国银, 林良斌, 徐小刚, 2010, 云南野生油菜的收集及农艺性状的评价, 种子, 29(7): 64-67)

Kozaki A., Mayumi K., and Sasaki Y., 2001, Thiol-disulfide exchange between nuclear-encoded and chloroplast-encoded subunits of pea acetyl-CoA carboxylase, J. Biol. Chem., 276(43): 39919-39925

Post-Beittenmiller D., Roughan G., and Ohlrogge J.B., 1992, Regulation of plant Fatty Acid biosynthesis: analysis of acyl-coenzyme a and acyl-acyl carrier protein substrate pools in spinach and pea chloroplasts, Plant Physiol., 100(2): 923-930

Roesler K., Shintani D., Savage L., Boddupalli S., and Ohlrogge J., 1997, Targeting of the arabidopsis homomeric acetyl-coenzyme a carboxylase to plastids of rapeseeds, Plant Physiol., 113(1): 75-81

Slabas A.R., and Fawcett T., 1992, The biochemistry and molecular biology of plant lipid biosynthesis, Plant Mol. Biol., 19(1): 169-191

Thelen J.J., and Ohlrogge J.B., 2002, Both antisense and sense expression of biotin carboxyl carrier protein isoform 2 inactivates the plastid acetyl-coenzyme a carboxylase in Arabidopsis thaliana, Plant J., 32(4): 419-431

Thelen J.J., Mekhedov S., and Ohlrogge J.B., 2000, Biotin carboxyl carrier protein isoforms in Brassicaceae oilseeds, Biochem. Soc. Trans., 28(6): 595-598