氮素是植物生长发育过程中所必须的大量元素，缺少氮素植物将不能正常生长，而氮肥施用过量也将带来严重的生态问题(Frink et al., 1999)。植物主要是通过吸收铵态氮(NH₄⁺-N)和硝态氮(NO3^--N)来获得氮素营养，但研究发现，植物利用氮素最有效、最快捷的方法是寡肽运输(Komarova et al., 2008)。植物体内存在很多的寡肽转运蛋白基因，植物利用这些基因将寡肽转运到植物细胞内水解成氨基酸，而寡肽水解成的氨基酸将成为植物碳、氮的重要来源(Delrot et al., 2000)，也是蛋白质合成的底物(Steiner et al., 1994; Perry et al., 1994)。寡肽转运基因在植物细胞、组织、器官之间的物质传递过程中起到重要作用，调控植物生物量的积累(Hirel et al., 2001)、氮素的利用效率(Waterworth and Bray, 2006)、胚胎发育(Almagro et al., 2008)、种子萌发及生长发育(Stacey et al., 2006)、有机氮在植株衰老过程的重新分配(Endler et al., 2006)，为植物的生长和发育提供氮素和碳素营养(Lin et al., 2000)。目前，对于寡肽转运蛋白基因家族OPT的功能研究还比较少，研究较多的作物主要是拟南芥(Koh et al., 2002)和水稻(Liu et al., 2012)，并陆续在杨树和葡萄(Cao et al., 2011)、玉米(高慧等, 2011)等植物上被研究。

黄瓜的生产过程中需要大量氮肥，在氮素缺乏的情况下，黄瓜植株不能获得足够的氮素营养，而寡肽转运蛋白基因(OPT)参与植物对氮素的利用及在植株中的再分配等(Lubkowitz, 2006)，可能参与黄瓜的低氮胁迫应答反应，为黄瓜生长发育提供所必须的氮素。本实验室前期Solexa测序研究发现，在低氮胁迫下黄瓜叶片内OPT基因的表达量增加，可能参与黄瓜低氮胁迫应答，提高黄瓜耐低氮能力(冯卓, 2012)。因此，克隆黄瓜OPT基因，对其进行生物信息学的分析和低氮胁迫下的表达研究，探讨其在低氮胁迫下发挥的作用，为该基因的功能研究奠定初步基础。

1结果与分析
1.1 RNA检测结果
Trizol法提取的黄瓜幼苗根、茎、茎尖和叶片RNA条带清晰无拖尾，浓度较高，符合OD值范围，无降解及污染，反转录成cDNA，cDNA的浓度和纯度较好，-20℃保存备用

1.2 OPT基因编码区全序列的获得
采用RT-PCR扩增的方法，获得1条2 000 bp左右的目的带(图1)，将目的带与载体连接后进行酶切检测(图2)，获得含有目的片段阳性菌液送天津华大有限公司测序。测序结果显示，基因全长2 013 bp，含有起始密码子ATG和终止密码子TAA。使用Clustal x将获得的序列与基因组数据库Csa020719基因序列进行比对，发现两序列完全一致，证明已成功克隆黄瓜OPT基因。

图1 PCR产物 注: M: DL2000 DNA marker; 1: PCR产物 Figure 1 PCR product Note: M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product

图2 酶切鉴定结果 注: M: DL2000 DNA marker; 1: 质粒的酶切鉴定 Figure 2 Identification by restriction enzymes digestion Note: M: DL2000 DNA marker; 1: Identification of pT-OPT by restriction enzymes digestion

1.3黄瓜OPT基因的生物信息学分析
1.3.1 OPT编码蛋白的理化性质
利用DNAMAN软件翻译黄瓜OPT基因序列，发现其编码670个氨基酸(图3)。利用protparam (http://www.expasy.ch/toosl/protparam.html/)分析OPT基因所编码蛋白的理化性质，该蛋白由20种氨基酸组成(表1)，分子量和理论等电点为73 912.0和8.65。分子式为C₃₄₄₇H₅₂₇₉N₈₁₇O_908S38，其中C、H、N、O和S所占比例分别为53.05%、6.92%、16.96%、21.52%和1.55%。分析结果显示该蛋白稳定系数(Instability index)是32.82，当稳定系数大于40时为不稳定蛋白，则OPT编码蛋白为稳定蛋白。预测该蛋白的脂肪系数(Aliphatic index)和总平均亲水性(grand average of  hydropathicity, GRAVY)分别为101.60和0.470。

 

图3 黄瓜OPT基因序列翻译为氨基酸序列 Figure 3 Cucumber OPT gene sequence was translated into the amino acid sequence

表1 OPT编码的氨基酸组成分析 Table 1 The composition of the amino acids encoded by OPT

1.3.2黄瓜OPT基因编码蛋白序列的同源性分析及分子进化树构建
将黄瓜OPT基因的氨基酸序列通过NCBI的BLAST比对发现，黄瓜OPT基因所编码的蛋白与毛果杨(Populus trichocarpa Torr. & A. Gray ex Hook)同源性最高为81%、其次是蓖麻(Ricinus communis L.)为79%，同源性都较高。OPT基因编码的蛋白与大豆(Glycine max (L.) Merr.)、葡萄(Vitis vinifera L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、水稻(Oryza sativa)的金属烟酰胺转运蛋白和苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)、苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)寡肽转运蛋白亚族YSL (yellow stripe like)的相似性也很高，分别为78%、77%、73%、78%、73%、62%和69%。

使用ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)构建OPT基因编码蛋白的进化树(图4)。结果显示黄瓜OPT编码蛋白与毛果杨、蓖麻的寡肽转运蛋白的遗传距离较近，与大豆金属烟酰胺转运蛋白和苜蓿YSL转运蛋白等关系也较近。蛋白功能相似的界限为25%，不同种属相似的界限为30% (Gilmour et al., 2000)，而黄瓜OPT基因所编码的蛋白与其他物种金属烟酰胺转运蛋白和YSL转运蛋白的同源比较都在60%以上，可能也参与金属离子和烟草胺的转运。

图4 OPT基因分子进化分析 注: 横线上数据为遗传距离; 1: 黄瓜; 2: 拟南芥(NP_200167.2); 3: 二穗短柄草(XP_003580252.1); 4: 水稻(BAD72770.1); 5: 蓖麻(XP_002515673.1); 6: 毛果杨(XP_002318472.1); 7: 大豆(XP_003527996.1); 8: 苜蓿(XP_003602315.1); 9: 苹果属小金海棠(AEQ28192.1); 10: 葡萄(XP_002274166.1) Figure 4 Phylogenetic analysis of OPT Note: The number on the line is the genetic distance; 1: Cucumber; 2: Arabidopsis thaliana (NP_200167.2); 3: Brachypodium distachyon (XP_003580252.1); 4: Oryza sativa Japonica (BAD72770.1); 5: Ricinus communis (XP_002515673.1); 6: Populus trichocarpa (XP_002318472.1); 7: Glycine max (XP_003527996.1); 8: Medicago truncatula (XP_003602315.1); 9: Malus xiaojinensis (AEQ- 28192.1); 10: Vitis vinifera (XP_002274166.1)

1.3.3 OPT编码蛋白活性位点分析
利用Scanprosite分析软件(http://prosite.expasy.org/scanprosite/)对其蛋白活性位点进行分析，结果显示OPT基因编码的蛋白具有9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(Casein kinase ò phosphorylation site)，4个氮-糖基化位点(N-glycosylation site)，8个蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)，16个氮酰基化位点(N-myristoylation site)和1个酪氨酸激酶磷酸化位点(Tyrosine kinase phosphorylaion site)。

1.3.4 OPT编码蛋白疏水性/亲水性的预测和分析 
利用protscale分析软件(http://web.expasy.org/protscale/)预测OPT基因编码蛋白的亲-疏水性，第80位赖氨酸疏水分值最高是3.378，第22位丝氨酸亲水分值最高是-3.278，在0基准线以上的疏水峰明显多于基准线以下的亲水峰。则预测黄瓜OPT基因编码的蛋白是疏水蛋白，与expasy预测总平均亲水性0.470为疏水蛋白的结果一致(总平均亲水性正值是疏水蛋白)。

1.3.5 OPT编码蛋白信号肽预测和分析
利用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行黄瓜OPT基因编码蛋白信号肽预测，结果显示第67位氨基酸残基的原始剪切位点分值最高是0.106，第64位氨基酸残基的信号肽分值最高是0.161，而第32位氨基酸残基的综合剪切位点分值最高是0.111，从1到31氨基酸残基的平均信号肽分值是0.097，说明该蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白，这与TargetP (http://genome.cbs.dtu.dk/services/TaretP/)预测sp为0.023小于1无信号肽的结果一致。

1.3.6 OPT编码蛋白的亚细胞定位与跨膜结构的预测
亚细胞定位工具ngLOC (http://golgi.unmc.edu/ngLOC/)将黄瓜OPT编码的蛋白主要定位到质膜上，分值为39.93。这一结果结合TMHMM (http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0)预测的该蛋白含有14连续的跨膜结构和protscale预测的OPT编码蛋白是疏水性蛋白，推测黄瓜OPT编码蛋白与代谢物质的跨膜转运有关。

1.3.7 OPT编码蛋白的保守结构域预测
利用CDD (http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/)预测黄瓜OPT基因编码蛋白的保守结构域，发现该蛋白具有一个位于40~660位氨基酸之间的典型OPT家族保守结构域。由此可以得出，黄瓜OPT基因所编码的蛋白属于OPT蛋白家族，黄瓜OPT基因属于OPT基因家族。

1.3.8预测黄瓜OPT基因所编码蛋白的功能
使用Profun (http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)在线预测OPT编码蛋白的功能，从功能类别中可以看出，黄瓜OPT基因所编码的蛋白的功能主要是参与运输和连接，概率为0.769，其次为参与辅助因子生物合成和翻译分别为0.225和0.139，还有一些较小概率参与中间代谢和嘌呤与嘧啶的合成等功能。而从基因分类看，黄瓜OPT基因编码的蛋白主要属于转运子类别，概率为0.496。黄瓜OPT基因编码蛋白主要功能是运输与转运。

1.4低氮条件下黄瓜OPT基因的表达分析
运用荧光定量分析了黄瓜OPT基因在不同氮浓度处理条件下的表达变化。同一氮浓度下不同植物器官分析结果显示(图5)，在无氮及低氮胁迫下，OPT基因在茎中表达量最高，其次为叶和茎尖；在高氮条件下，OPT主要在茎尖和叶中表达，茎稍低于茎尖和叶，说明黄瓜OPT基因在氮胁迫下存在于黄瓜各个部位，并主要集中在生长旺盛的部位，为黄瓜的生长提供所需的能量。不同氮浓度下OPT在茎中表达量显示(图6)，OPT基因在无氮及低氮下表达量增加，明显高于正常水平，并且随着氮浓度的降低，OPT的表达量增加。说明OPT基因在低氮胁迫下快速应答，提高黄瓜耐低氮能力。在高氮胁迫下，OPT的表达量先降低后升高，这可能与高氮胁迫程度和黄瓜吸收氮的能力有关。

图5 相同氮浓度下OPT基因在植株不同部位表达量 Figure 5 OPT genes expressed in different parts of the same concentration of nitroge

图6 不同氮浓度处理下OPT基因在茎的表达量 Figure 6 OPT genes expressed in stem under different Nitroge co- ncentration

2讨论
本研究根据黄瓜基因组数据库Csa020719基因编码区全长设计引物，采用RT-PCR方法从耐低氮黄瓜品种津研四号叶片中克隆获得OPT基因并对其功能进行预测。OPT编码蛋白保守结构域预测显示该蛋白有1个典型的OPT保守结构域，说明克隆的黄瓜OPT基因属于OPT家族，黄瓜OPT基因编码的蛋白与大豆金属烟酰胺转运蛋白和苜蓿YSL转运蛋白的亲缘关系较近，说明黄瓜OPT基因可能还参与转运金属离子与烟草胺的螯合物的作用。

目前，质子寡运蛋白家族的基因已在许多植物上被研究，而其功能也是研究的重点(Lubkowitz, 2011)。植物通过OPT基因获得根系周围的氮素，将其运输到植物细胞，提供植物生长发育的氮素营养，提高氮素的利用效率(Waterworth and Bray, 2006)，而且有一些质子寡运蛋白是构成细胞膜所必须的(Vasconcelos et al., 2008)，但其对低氮胁迫的响应的研究还比较少。本研究无论在无氮、低氮、还是高氮胁迫下，黄瓜OPT基因都是在生长旺盛部位茎，茎尖和叶中表达量较高，根部表达相对较低，结合OPT功能预测结果，OPT可能通过根吸收有机氮，通过茎运输，并转移到叶与茎尖，为黄瓜生长提供营养物质。不同浓度下OPT在茎中表达量显示，OPT基因在无氮及低氮下表达量明显高于正常水平，并且随着氮浓度的降低，OPT的表达量增加，这一研究结果与本实验室前期测序结果一致，说明OPT在低氮胁迫下参与黄瓜体内氮代谢，为黄瓜生长提供营养物质。 

植物氮代谢途径已被广泛研究(Masclaux-Daubresse et al., 2010; Miller et al., 2007; Tsay et al., 2007)，与植物氮代谢相关的基因也研究的较多(Wang and Tsaya, 2011; Li et al., 2010)，但黄瓜氮代谢相关的基因研究还处于初始阶段，随着黄瓜基因组测序的完成(Huang et al., 2009)，黄瓜同源基因的克隆将会逐渐增多。本研究利用RT-PCR方法克隆了黄瓜OPT基因，并对其生物信息学功能以及氮胁迫下表达分析进行研究。该基因的分离以及初步分析为进一步研究该基因的功能提供了参考依据，也为通过基因工程方法研究黄瓜氮胁迫机理奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
本研究材料为耐低氮黄瓜(Cucumis sativus L.)品种‘津研4号’，采用净河沙栽培，子叶展平开始浇灌营养液，Bluepard人工气候箱培养，光照14 h，昼温为25℃，夜温为18℃，湿度65%。本研究设置7个处理，四个低氮处理浓度为0、1 mmol/L、2 mmol/L和4 mmol/L，正常处理(对照)浓度为7 mmol/L，两个高氮处理浓度为9 mmol/L和11 mmol/L。7个处理除浇灌相同的微量元素(10 μmol/L MnSO₄, 24 μmol/L H₃BO₃, 3 μmol/L ZnSO₄, 0.9 μmol/L CuSO₄, 0.04 μmol/L (NH₄)₆Mo₇O₂₄和10 mg/L EDTA铁钠)外，正常处理浇灌1/2日本山崎黄瓜的专用营养液(1.75 mmol/L Ca(NO₃)₂, 3 mmol/L KNO₃, 0.5 mmol/L NH₄H₂PO₄, 1 mmol/L MgSO₄)，而高氮与低氮处理是在正常处理的基础上使用CaCl₂、KCL、KH₂PO₄和Mg(NO₃)₂替换，但保证其他营养成分基本不变(冯卓等, 2012)。三叶一心取材(处理约22 d)，分别将15个单株的根、茎、茎尖、叶片剪碎混匀，锡纸包裹迅速冻于液氮，-80℃保存备用。

3.2各部位总RNA提取及cDNA合成与检测
本研究采用Trizol (Invitrogen)法提取7个处理黄瓜幼苗根、茎、茎尖和叶片总RNA，使用1.2%琼脂糖凝胶电泳和SMA3000分光光度计检测提取的RNA浓度和纯度，将符合条件的RNA根据RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI)说明书反转录为cDNA，并使用SMA3000分光光检测cDNA的质量与浓度。

3.3 OPT相关引物设计与合成
本研究使用Primer Premier 5.0软件，根据黄瓜基因组数据库中Csa020719基因编码区全序列设计引物。PCR扩增上游引物为HGOPT-F：5'-ATGAGGAACTCCATCATAGA-3'含有起始密码子ATG，下游引物为HGOPT-R：5'-TTAACTTTTACTAGAAGAAAAA-3'，能扩增出终止密码子TAA，即扩增出黄瓜OPT基因编码区完整序列。荧光定量上游引物为：qHGOPT-F：5'-AAGAAGTTGAAAACATTCCCT GAT-3'，下游引物为qHGOPT-R：5'-CTGTGATTGCCACCCATACC-3'，可扩增出编码区内一段100 bp左右序列，检测OPT基因在各浓度下各部位的表达量。β-actin上游引物：β-actin-F：5'-CCACCAATCTTGTACACATCC-3'；下游引物为：β-actin-S：5'-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3'，引物均由上海生工生物工程技术公司合成。

3.4黄瓜OPT基因的PCR扩增与分析
采用RT-PCR方法从低氮处理叶片cDNA中分离黄瓜OPT基因，PCR体系为20 μL，含有2 μL模板cDNA，2 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTP Mix，0.5 μL的上游引物(10 μmol/L)和0.5 μL的下游引物(10 μmol/L)，0.2 μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，12.8 μL ddH₂O。反应条件设定为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，47℃ 30 s，72℃ 60 s，循环30次；72℃，10 min；4℃ forever。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的目的条带使用DNA纯化/回收试剂盒(百泰克)回收，纯化的目的带与pEASY-T3载体(全式金)连接后转化到T1感受态细胞，37℃过夜培养12 h，出现蓝白斑后，挑取白色单菌落进行菌液培养。质粒小提试剂盒(百泰克)提取菌液质粒进行酶切鉴定，选取含有目的片段的菌液送天津华大测序。使用NCBI、CBS、ExPASY、EMBL-EBI和ngLOC等网站，以及DNAMAN、ClustalX、RasMol等程序进行序列分析及编码蛋白相关信息预测。

3.5低氮条件下黄瓜OPT基因的表达分析
提取无氮、低氮、对照和高氮处理植株的根、茎、茎尖和叶片总RNA，检测RNA浓度与纯度符合条件后将其反转录为cDNA，检测所转录cDNA的浓度和纯度，符合条件后-20℃保存，用于荧光定量PCR。荧光定量的体系为20 μL，含有10 μL SYBR Green PCR Master Mix (东洋纺0, 2 μL模板cDNA, 7 μL无菌水, 0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物)。反应条件设定为95℃反应3 min；95℃反应10 s，55℃反应20 s，72℃反应30 s，设定40个循环；55℃反应10 s，设定81次循环；4℃反应10 min。本研究选用β-actin作为相对定量的参照基因。

作者贡献
何红梅是本研究的实验设计和实验研究的执行人并完成实验、数据分析和论文初稿的写作；冯卓和武涛参与实验设计，试验结果分析；辛明和周秀艳为本实验提供材料与帮助；秦智伟是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31101545)、农业部东北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室和黑龙江省寒地蔬菜生物学重点实验室共同资助。

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