氮素作为植物生长发育所必须的矿质营养元素之一，同时也是限制产量的重要因子之一，主要被用来合成氨基酸、蛋白质、叶绿素、核酸、脂类及一些其他的含氮化合物。土壤中存在的氮素形态主要是铵态氮和硝态氮，铵盐的浓度通常很低，一般不超过50 μmol/L，而硝酸盐的浓度是铵盐浓度的10~1 000倍(刘婷等, 2011)。由于在植物以内的氮素同化及代谢的过程中，铵离子(NH₄⁺)起着重要性的作用，因为它是生物体内所有氮源的最终代谢产物和生物体内所需的氨基酸、核酸和辅因子等氮类化合物的生物合成的底物(Bloom et al., 1992)。因此，铵离子(NH₄⁺)被认为是植物根系吸收利用的最为有效的氮素形式，也是植物体内氮素转运的主要形式之一。

植物根系对土壤中NH₄⁺ 的吸收及NH₄⁺在植物各器官、组织中的转运，是由位于质膜上存在的铵转运蛋白(ammonium transporter, AMT)介导的需能主动运输的过程，它在细胞的氮同化代谢过程中起着重要的作用(Loqué and von Wirén, 2004; 邓若磊等, 2007)。Ninnemann等人早在1994年利用缺失两个高亲和的转运蛋白MEP1与MEP2及一个低亲和的转运蛋白MEP3的酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变体31019b进行功能互补试验的研究，在拟南芥中分离得到了植物种属中第一个铵转运蛋白(AtAMTI.1)，随后大量的研究学者对不同植物种属中的铵转运蛋白的功能研究给予了更多的关注，目前在不同的植物种属中分离鉴定得到的铵转运蛋白大多是高亲和性蛋白。
近年来通过生物信息学对铵转运蛋白的结构序列进行分析，研究发现，一些植物铵转运蛋白在N末端疏水区存在信号序列(Von Wiren et al., 1997)。Ludewing等的研究表明，LeAMT1;1的C端保守的甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)导致转运铵的活性丧失(Ludewig et al., 2003)。此外，对拟南芥AMT1的C末端磷酸化位点进行点突变的结果显示，可以增强对NH₄⁺的吸收，但同时降低了甲胺的吸收量(Loqué et al., 2009)。以上这些研究都说明不同的拓扑结构可能直接影响着吸收转运铵的能力，主要通过高度保守的细胞质C末端与相邻三聚物的亚基相互作用，从而改变了蛋白质的构象调节AMT的运输能力，可以减少或降低铵毒害对植物的伤害。
本研究通过构建PutAMT-GFP融合蛋白植物表达载体，观察了PutAMT-GFP在拟南芥叶肉细胞原生质体内的定位。此外，构建了N、C及NC末端缺失的突变体(ΔNPutAMT, ΔCPutAMT及ΔNCPutAMT)的酵母表达载体，通过酵母突变体菌株31019b解析了对NH₄⁺吸收的影响。

1结果与分析
1.1 PutAMT在拟南芥原生质体中的定位研究
本研究通过去除掉PutAMT基因的终止子序列(TAA)，与GFP基因的功能区部分相连，从而形成了PutAMT-GFP的融合基因，再利用KpnⅠ与SalⅠ双酶切获得PutAMT-GFP与pBI121植物表达载体连接，将获得的pBI121-PutAMT-GFP与pBI121-GFP质粒通过电转化转入农杆菌菌株EHA105中，侵染野生型拟南芥，并在含有卡那霉素的1/2MS培养基上筛选，获得转基因植株，提取转基因拟南芥的原生质体在荧光显微镜488 nm光的激发下观察(Olympus Fluoview, FV500, Japan) (图1)。结果表明，pBI121-GFP作为对照，其荧光信号主要分布在细胞质中，没有特异的定位(图1A; 图1B)。而PutAMT-GFP主要定位在质膜上，在质膜以外的类似内质网的区域也许有部分定位(图1D; 图1E)。通过大量的原生质体细胞的观察，也存在点状(类似小泡)、棒状、不规则的分布于细胞内(图1G-图1O)，并且分布在质膜等其他位置。目前，利用绿色荧光蛋白技术证明了植物种属中的铵转运蛋白基因大多数定位于质膜上(Claros et al., 1997; Loqué et al., 2006; Yuan et al., 2007; 2009; Rogato et al., 2010)。本研究的结果表明PutAMT-GFP除了定位在质膜以外，还在其它的位置存在，具有复杂性、多样性的特点，这个现象是值得进一步关注的。
 

图1 PutAMT在植物中的亚细胞定位 Figure 1 Subcellular localization of PutAMT in plant

1.2 PutAMT结构对NH₄⁺吸收功能的影响
PutAMT、ΔNPutAMT、ΔCPutAMT与ΔNCPut- AMT转化至酵母突变体(31019b, 该菌株缺失了两个高亲和铵转运蛋白MEP1与MEP2，及一个低亲和铵转运蛋白MEP3，而不能有效的吸收NH₄⁺)，转化子在低氮培养基上培养，在1 mmol/L NH₄⁺作为唯一氮源的条件下，只有全长PutAMT的31019b转化子可以正常生长，而转化了空载体pYES2的31019b不能正常生长。这个结果表明了，全长PutAMT能够有效的吸收NH₄⁺，对突变体31019b具有NH₄⁺吸收的互补作用。因此，PutAMT是具有高亲和NH₄⁺吸收能力的铵转运蛋白。
与全长PutAMT相比，ΔNPutAMT、ΔCPutAMT及ΔNCPutAMT的31019b转化子在低氮条件下均不能正常生长(图2)。随着培养基中NH₄⁺浓度的升高，除了PutAMT的31019b转化子可以正常生长外，转化了空载体pYES2的31019b和ΔNPutAMT、ΔCPutAMT及ΔNCPutAMT的31019b转化子也都能正常生长，当外界NH₄⁺浓度达到20 mm/L时，转化了空载体pYES2的31019b和ΔNPutAMT、ΔCPutAMT及ΔNCPutAMT的31019b转化子几乎同PutAMT的31019b转化子一样都够生长良好。本试验的研究结果表明，PutAMT的N末端及C末端的缺失对在外界低浓度(1 mmol/L)的NH₄⁺条件下完全丧失吸收NH₄⁺的能力，只有全长PutAMT的31019b转化子具有吸收NH₄⁺的功能，说明N末端及C末端对PutAMT吸收NH₄⁺功能发挥具有一定的重要性。Ludewing等的研究也表明，C末端位点的突变会导致吸收NH₄⁺的功能的丧失(Ludewig et al., 2003)，此外很多的研究结果也证明C末端单个氨基酸位点的突变与转运铵的能力密切相关(Merrick et al., 2006; Loqué et al., 2007)。
 

图2 PutAMT, ΔNPutAMT, ΔCPutAMT与ΔNCPutAMT对NH4+吸收缺陷酵母突变体菌株31019b的功能互补分析 Figure 2 The functional complementary analysis of PutAMT, ΔNPutAMT, ΔCPutAMT and ΔNCPutAMT to yeast mutant strain

2讨论
铵态氮作为植物生长的重要氮素来源，在农业生产上对作物产量起到至关重要的作用。NH₄⁺吸收到植物体内，在谷氨酰胺合成酶及谷氨酸合成酶等重要酶的作用下合成生物体所必要的活性物质，如氨基酸、蛋白质、叶绿素、核酸、脂类及一些其他的含氮化合物。NH₄⁺ 的吸收及在各器官中的转运，主要是通过铵转运蛋白(ammonium transporter, AMT)介导的需能主动运输的过程(Loqué and von Wirén, 2004; 邓若磊等, 2007)。植物根对NH₄⁺的吸收主要通过H⁺-ATPase在质膜形成H⁺梯度，使AMT在能量作用下将NH₄⁺转入细胞内。本研究在星星草中分离克隆得到的PutAMT与小麦、水稻等AMT具有较高的同源性。利用缺失两个高亲和铵转运蛋白MEP1与MEP2及一个低亲和铵转运蛋白MEP3的酵母(Saccharomyces cerevisiae)突变体31019b进行功能互补试验的研究发现，在低氮条件下PutAMT具有较强的NH₄⁺吸收能力(图2)。因此，本研究推测PutAMT属于AMT1家族的高亲和铵转运蛋白成员。这个结果与前人对拟南芥AtAMTI.1、AtAMTI.4 (Ninnemann et al., 1994; Yuan et al., 2009)以及水稻OsAMT1;1-OsAMT1;3 (Sonoda et al., 2003; Kumar et al., 2003)的报道相似。目前，关于铵转运蛋白的结构对AMT功能的影响的研究报道较少，本研究通过构建N、C或NC末端同时缺失的PutAMT转化至酵母突变体31019b中，并通过不同浓度的NH₄⁺培养实验表明，N、C末端均对NH₄⁺的吸收具有重要的作用。近年来的研究发现，LeAMT1;1的C端保守的甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)导致转运铵的活性丧失(Ludewig et al., 2003)。此外，对拟南芥AMT1的C末端磷酸化位点进行点突变的结果显示，可以增强对NH₄⁺的吸收，但同时降低了甲胺的吸收量(Loqué et al., 2009)。以上这些研究都说明不同的拓扑结构可能直接影响着吸收转运铵的能力。 
目前，关于植物铵转运蛋白在细胞内的定位研究有较多的报道，大多数的研究结果表明AMT主要定位于质膜上(Claros et al., 1997; Loqué et al., 2006; Yuan et al., 2007; 2009; Rogato et al., 2010)。本研究通过获得PutAMT-GFP的转基因植株，提取原生质体观察结果表明，PutAMT与其它植物种属AMT的定位报道相似，主要分布在质膜上，然而本实验通过对不同的时期，大量的观察发现，也在细胞内存在点状(类似小泡)、棒状、不规则的分布(图1G-图1O)。以上这些结果暗示PutAMT-GFP除了定位在质膜以外，还在其它的位置存在，推测可能存在动态变化的特性，表现了定位具有复杂性、多样性的特点。

3材料与方法
3.1材料
植物材料：哥伦比亚野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)。菌株及表达载体：大肠杆菌(E. coli) Jm109；农杆菌菌株EHA105以及酵母突变体菌株31019b (mep1Δmep2Δ::LEU2 mep3Δ::KanMX2 ura3)。酵母表达载体pYES2 (Invitrogen)与植物表达载体pBI121 (Clontech)。

3.2 PutAMT、ΔNPutAMT、ΔCPutAMT与ΔNCPut- AM的克隆
如图3所示原理，构建碱茅PutAMT基因N末端或C末端以及N、C末端同时截断的三种形式，分别在截取了的PutAMT基因的N末端或C末端处设计引物。试验中扩增PutAMT、ΔNPutAMT、ΔCPutAMT及ΔNCPutAM所用到的引物组合如下：PutAMT：上游引物5'-GAATTCATGTCGACGTGCGCG-3' (EcoRⅠ)，下游引物5'-TCTAGACTAGACGTGGCCGCCA-3' (XbaⅠ)；ΔNPutAMT：上游引物5'-GAATTCATGTACCTATGCAACCGG-3'，下游引物5'-TCTAGACTAGACGTGGCCGCCA-3' (XbaⅠ)；ΔCPutAMT：上游引物5'-GAATTCATGTCGACGTGCGCG-3' (EcoRⅠ)，下游引物5'-TCTAGATAAGTCGTCGTCGTTGTA-3'；ΔNCPutAMT：上游引物5'-GAATTCATGTACCTATGCAACCGG-3'，下游引物5'-TCTAGATAAGTCGTCGTCGTTGTA-3'。
 

图3 PutAMT基因N末端及C末端构建原理 Figure 3 The principle of constructing N- or C-terminally truncated and both N- and C-terminally truncated forms

3.3 PutAMT、ΔNPutAMT、ΔCPutAMT与ΔNCPut- AM酵母突变体遗传转化及吸收NH₄⁺的功能鉴定
扩增得到的PutAMT全长与ΔNPutAMT、ΔCPutAMT及ΔNC PutAMT克隆到酵母表达载体pYES2(Invitrogen)，再转入酵母突变体菌株31019b，转化子在SD-Uracil培养基上进行筛选。为鉴定得到的PutAMT、ΔNPutAMT、ΔCPutAMT与ΔNCPutAMT对酵母突变体菌株31019b吸收NH₄⁺的功能互补作用，向不含氮源的YNB培养基中添加2%半乳糖，另外添加0、5 mmol/L、10 mmol/L或20 mmol/L (NH₄)₂SO₄作为唯一的氮源。分别将PutAMT、ΔNPutAMT、ΔCPutAMT与ΔNCPutAMT遗传转化31019b的转化子以及未转化空表达载体pYES2的31019b转化菌株稀释成10-1~10-4点点于固体YNB培养基上，30℃培养3 d后鉴定。酵母转化根据Gietz等(1995)的方法操作。

3.4 PutAMT拟南芥原生质体转化
依据PutAMT基因的编码阅读框区域，合成引物并在引物中引入KpnⅠ与SalⅠ酶切位点，上游引物：5'-AAGCTTATGGTGAGCAAGGG-3'，下游引物：5'-GAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。从PutAMT-PMD18-T重组质粒中扩增PutAMT基因的ORF，构建融合PutAMT-GFP基因。将连接好的PutAMT-GFP与植物表达载体pBI121用KpnⅠ与SalⅠ进行双酶切，将获得的pBI121-PutAMT-GFP与pBI121-GFP质粒通过电转化转入农杆菌菌株EHA 105中，侵染野生型拟南芥，在1/2MS培养基中添加卡那霉素，筛选获得转基因植株，提取转基因拟南芥的原生质体并在荧光显微镜488 nm光的激发下观察(Olympus Fluoview, FV500, Japan)。

作者贡献
卜媛媛是本研究的实验设计和实验研究的执行人并完成了论文初稿的写作；孙博、周爱民及骆媛媛参与实验设计及数据分析；柳参奎博士是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家林业局948项目(2008429)资助。感谢中国农业大学袁力行教授为本研究提供的酵母突变体菌株31019b。

参考文献
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