玉米在中国的粮食作物中位居第二位，其在国民经济中占有异常重要的地位。玉米既可作为粮饲作物又可作为医药及工业原料，产量相对较高，但耐盐碱性较差，一旦土壤中可溶性盐含量过高时，就会抑制其生长发育，造成减产。因此，在我国土地盐碱化恶劣的情况下，利用育种方法选育高产优质的耐盐碱品种，对发展我国农业生产具有重要的意义。然而由于可用的耐盐育种材料稀缺，常规育种技术无法达到满意的效果，并且过程极为缓慢。

伴随着植物基因工程的飞速发展，有望利用基因工程手段培育耐盐碱的作物来达到改良大面积盐碱地的目的，恢复生态平衡，同时推动农民增收致富。科研人员在耐盐碱机理以及培育耐盐碱品种方面取得了明显的进步(李景欣等, 2005; 常红军和马灿玲, 2006; 祁栋灵等, 2005; 2006; Shi et al., 2002)。

DREB类转录因子是AP2/EREBR转录因子大家族中的一个亚家族，这个亚家族具有保守的AP2结构域，能和抗逆基因启动子区域的DRE顺式作用元件特异性地结合，在盐碱、干早、低温等环境下调控下游逆境应答基因的表达，属于逆境适应中关键性调节因子。

本研究试图通过农杆菌介导法将耐盐基因DREB2A转入玉米自交系H99以及杂交种H99×A188中，获得抗旱耐盐的优良玉米种质资源。同时研究侵染时间、农杆菌浓度及AS浓度等制约转化效率的因素，建立完善农杆菌转化体系。

1结果与分析
1.1菌液浓度对愈伤组织遗传转化的影响
本实验采用侵染时间一致，用农杆菌OD₆₀₀值为0.2、0.3、0.4、0.5和0.6的菌液浓度转化愈伤。一共5个处理，每个处理3个重复，每个重复100个外植体。统计转化率以及抗性愈伤率确定最适浓度。实验显示，OD₆₀₀值为0.5~0.6时农杆菌繁殖能力以及感染效果最佳(图1)。
 

1.2不同侵染时间对遗传转化的影响
实验中取H99×A188和H99的Ⅱ型胚性愈伤，以菌液浓度OD₆₀₀为0.5~0.6的菌液分别侵染Ⅱ型胚性愈伤，设定以下几个时间10 min、15 min、20 min、25 min和30 min侵染。随后转入共培养基中培养3 d，3 d后转入筛选培养基，进行3次筛选工作。结果显示，不断延长侵染时间，抗性愈伤获得率不断提高，侵染20 min时的抗性愈伤获得率最高分别为34.0%和47.3%；而侵染超过25 min，愈伤褐化死亡,抗性愈伤获得率降低；侵染时间不到20 min可导致入侵到细胞壁表面的菌体不足，转化率同样降低。最后确定了适宜的侵染时间为20 min (图2)。
 

1.3乙酰丁香酮(AS)对遗传转化的影响
为了研究AS在玉米遗传转化中的效果并确定其最适浓度，在H99的Ⅱ型愈伤组织时在感染液或共培养基中设置了5个AS浓度梯度(0, 50 μmol/L, 100 μmol/L, 150 μmol/L和200 μmol/L)，每个梯度3个重复。

AS单独放入共培养基或者感染液中可微微提升抗性愈伤诱导率；而在这两种培养基中都加入AS，可以明显提升抗性愈伤诱导率。当AS浓度达到200 μmol/L时，抗性愈伤率反而降低，出现褐化现象。本研究中使用AS的适宜浓度为150 μmol/L (图3)。
 

1.4转基因植株分子检测
以玉米抗性植株的基因组DNA为模板，阳性对照为pCAMBIA3300-ubi-DREB2Am质粒，设立同一品种未转化植株基因组DNA为阴性对照以及水对照，以DREB2A基因的特异引物对待检测植株进行PCR扩增，一部分扩增结果如图4。阳性对照均能够扩增出目的条带，水对照和阴性对照无目的条带。
 

本实验用PCR方法共检测抗性植株110株，其中5株均能扩增出DREB2A基因的条带，PCR阳性率为4.54%。

2讨论
有研究表明，农杆菌侵染时间和菌液浓度是影响农杆菌转化的两个重要因素(农友业等, 2005)。在Zhao等(2002)研究中，随着农杆菌菌液浓度的增加GUS基因的瞬时表达率也跟着增高，而抗性愈伤诱导率就会下降。说明农杆菌浓度高对转化有利，但浓度不断增加，其大量吸附的也会难以抑制使转化率降低。在Gurlitz等(1987)研究认为吸附超过一定数量的农杆菌导致植物细胞存活率降低，降低转化率。农杆菌浓度过低侵染效果也不佳。本实验显示，OD值为0.5~0.6时农杆菌繁殖速度最快感染能力最强，最适合转化玉米愈伤。

侵染时间同样影响着转化率(邸宏等, 2008)。侵染时间过短，外植体吸附少量的农杆菌，T-DNA就不能有效转移导致转化率偏低；延长侵染时间，使农杆菌繁殖过度，外植体会而出现褐化现象而导致死亡，降低转化率，采用适当的侵染时间非常重要。王宏伟等(2011)采用农杆菌介导法侵染玉米自交系齐319的幼胚后发现侵染20 min的转化效率明显高于侵染15 min的转化效果，其GUS表达率23.46%也显著高于侵染15 min的6.7%的表达率。所以他确定最佳侵染时间为20 min。庄志扬等(2010)也认为胚性愈伤组织的最佳侵染时间为20 min，这与本实验研究结果一致。

单子叶植物被农杆菌转化的主要原因是单子叶植物中有对植物细胞吸附发生抑制和抑制农杆菌生长的信号分子。这种信号分子可以抑制农杆菌Vir基因的表达。许耀等(1993)用AS处理农杆菌然后与悬浮细胞共培养，发现多数细菌附着于水稻表面，因为AS是酚类化合物，可诱导农杆菌Vir基因的活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞，提高遗传转化效率。由此证实AS可以提高农杆菌的转化率。AS单独放入共培养基或者感染液可微微提升抗性愈伤诱导率；而在这两种培养基中都加入AS，可明显提升抗性愈伤诱导率(余云舟等, 2003)。本研究在感染液和共培养基中都加入AS，明显提升抗性愈伤诱导率。但是浓度太高抗性愈伤率反而降低，出现褐化现象，可能由于配置AS时用到的二甲基亚砜有毒。庄志扬等(2010)把AS加进共培养基以及浸染液中提高了转化率,选定了150 mg/L为AS适宜浓度。邸宏等(2008)在转化玉米幼胚的研究中感染液和共培养基中均加入AS后提高了幼胚的GUS瞬时表达率，确定了AS的适宜浓度为200 μmol/L。本研究中AS的适宜浓度为150 μmol/L。

3材料与方法
3.1玉米材料
选用优良玉米自交系H99以及杂交种H99×A188的Ⅱ型愈伤组织作为外植体进行研究。

3.2菌株和质粒
DREB2A基因为抗旱耐盐基因；大肠杆菌(E. coli) DH5α，农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens) EHA- 105，表达载体pCAMBIA3300-ubi-DREB2Am (图5)。
 

3.3培养基
YEP培养基：10 g/L酵母提取物，5 g/L蛋白胨，10 g/L牛肉浸膏，pH 7.0，固体培养基添加1.5%琼脂。

玉米继代培养基：N6+蔗糖30 g/L+2,4-D 1.0 mg/L+ 7.0 g/L琼脂粉。

玉米共培养培养基：MS+葡萄糖10 g/L+蔗糖20 g/L+150 μmol/L AS+7.0 g/L琼脂粉。

玉米感染液培养基：MS+葡萄糖10 g/L+蔗糖20 g/L+150 μmol/L AS。

玉米筛选培养基：N6+2,4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+头孢霉素500 mg/L+除草剂4.0 mg/L+7.0 g/L琼脂粉。

玉米分化培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+头孢霉素500 mg/L+7.0 g/L琼脂粉。

玉米生根培养基：1/2MS+IBA 1.0 mg/L+活性炭1.0 g/L+蔗糖30 g/L+7.0 g/L琼脂粉。

以上培养基于121℃高温高压灭菌20 min。

3.5农杆菌介导转化流程
 (1)侵染。往侵染液中添加AS至最终浓度为150 μmol/L，充分混匀倒入盛有玉米愈伤的培养皿中，浸泡时间20 min，隔5 min摇匀一下，随后弃掉菌液，在铺有无菌滤纸的培养皿中放入愈伤组织，滤去多余的菌液，再放入共体培养基中使其在28℃环境中暗培养72 h。

 (2)转移至筛选培养基中，筛选3次，形成的抗性愈伤再放到分化培养基中，分化出苗，最后移入生根培养基。

(3)选健壮的生根苗进行炼苗培养，最后移到大田用于生产。

3.6抗性植株分子检测
待温室中抗性再生植株长势稳定后提取叶片总DNA进行PCR检测。

以抗性植株基因组DNA为模板，同时分别以质粒pCAMBIA3300-ubi-DREB2Am和未转化植株作为对照。以DREB2A特异引物进行扩增。DREB2A引物序列为5'-GGGTAAATGGGTTGCTGAGA-3'和5'-ACATCGTCGCCATTTAGGTC-3'。反应循环体系为94℃ 5 min；94℃ 55 s；57℃ 55 s；72℃ 80 s；40个循环；72℃ 8 min；4℃保存。

作者贡献
王奕是本研究的实验设计和实验研究的执行人以及论文初稿的写作；任贤、蔡勤安、王奕完成数据分析；于志晶参与实验设计，试验结果分析；林秀峰和马瑞是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由农业部转基因专项(2009ZX08003- 018B)资助。

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