水稻是世界主要粮食作物之一，其高产问题一直是解决世界粮食问题中的关键问题(Subudhi et al., 2006)。而水稻产量与其光合作用能力是紧密相连的(Mann, 1999)，同时它也是研究植物功能组学的单子叶模式植物之一。因此，研究水稻的光合作用，对于探究单子叶植物光合作用机制有着参考意义。

水稻叶色突变体是研究水稻光合作用及其叶绿体发育的重要研究材料。据研究，水稻叶色突变体的类型主要有白化、黄化、浅绿、绿白、白翠、黄绿、绿黄和条纹8种类型(Awan et al., 1980)，其叶色失绿突变的原因主要有叶绿素合成受阻、叶绿体分化与发育受阻、质-核信号传导途径受阻、叶绿体蛋白转运受阻和其他与光系统无直接相关的基因突变等(陈青等, 2010)。

目前，有关失绿突变体的研究多集中在双子叶植物中，如拟南芥(Runge et al., 1995; Paddock et al., 2010)、油菜(吕明等, 2010)、桑树(贾俊丽等, 2008)、大豆(Jiang et al., 1997)、烟草(Shcherbakov and Shalygo, 2006)；而对于单子叶植物研究的对象不多，大多集中在小麦(Subrahmanyam, 2008)和水稻(郭士伟等, 2011; 李超等, 2010; 陈佳颖等, 2010; 祁鲁等, 2010; Chen et al., 2007)的研究上。据不完全统计，已报道的77个水稻叶色失绿突变基因在除水稻第12号染色体以外的其余11条染色体上均有分布(黄晓群等, 2005; Kurata et al., 2005; 陈青等, 2010)。

本试验对温敏感失绿突变体tcm12进行性状鉴定及突变基因的遗传分析和基因定位，首次发现了有与叶色失绿相关的基因位于水稻第12号染色体上，本试验结果为将来tcm12基因的克隆、功能研究及其实际应用提供理论依据。

1结果与分析
1.1突变体苗期叶色表型
突变体tcm12和野生型嘉花1号在4种温度(20℃, 24℃, 28℃和32℃)下的叶色表型如图1，野生型嘉花1号幼苗的叶色在四种温度下和任何叶龄均呈正常绿色。而突变体tcm12在20℃条件的二叶期的不完全(第1叶)叶表现为绿色，第2叶为黄白色，三叶期时的第2叶仍为黄白色，第3叶大部分为白色，部分开始转绿，至四叶期第4叶则完全表现为绿色(图1B)；但在24℃，28℃和32℃条件下，突变体tcm12表型与野生型嘉花1号无明显差别，均表现正常绿色。这些结果表明突变体具有温敏感失绿性状，并且仅发生在幼苗3叶期之前，其临界温度介于20℃和24℃之间。

图1 不同温度下突变体tcm12和野生型嘉花1号的叶色表型 Figure 1 Leaf-color phenotypes of mutant tcm12 and wild-type Jiahua No.1 under different temperatures

1.2突变体叶绿体结构
突变体tcm12和野生型嘉花1号在20℃和32℃条件下生长时，其叶绿体结构如图2所示。从图中可以看出嘉花1号在无论20℃还是32℃，每个叶肉细胞内均有叶绿体分布，叶绿体大小正常，可以看见完整清晰的基粒类囊体片层结构。然而，突变体tcm12在20℃条件下，虽然其叶绿体可以正常分裂，但大多数叶绿体都发育不完全(图2b)，并且叶绿体中没有完整清晰的基粒类囊体片层结构(图2d)；并且突变体tcm12在32℃条件下，无论是叶绿体的数量、大小及内部结构均与野生型嘉花1号相似。由此推断，突变体tcm12苗期失绿是低温条件造成叶绿体发育障碍所致。

图2 20℃和32℃条件下突变体tcm12和嘉花1号叶绿体结构 Figure 2 Structure of chloroplasts of the seedlings in the wildtype and mutant grown at 20℃ and 32℃

1.3突变体遗传分析
广占63S/tcm12和嘉花1号/tcm12的F₁代20℃条件下生长的表现型均为绿色，通过对其杂交后代F₂群体进行调查发现，经χ²验证正常表型植株和突变植株的比例均符合3:1分离比(表1)，表明该温敏感失绿性状是由单隐性核基因控制的，命名为tcm12。

表1 突变体性状在不同组合中的遗传分析 Table 1 Inheritance of mutant trait in different crosses

1.4突变体的基因定位
采用本实验室保存的81对SSR和自行开发的InDel分子标记引物，共检测到突变体tcm12和广占63S之间具有多态性明显的分子标记引物共43对，其基本上平均分布在水稻12条染色体上。然后从广占63S/tcm12的F₂代中随机挑选24株突变体型单株，用上述43对分子标记引物对其进行DNA带型分析，结果显示突变基因tcm12与分子标记RM519连锁(图3)，位于第12号染色体上，接着定位群体扩大到76株，将tcm12定位在RM519和ID22406之间(图4)，遗传距离分别为5.4 cM和6.5 cM，其物理距离约为2 503 kb；然后，采用该区间分子标记引物多态性较好(表2)的9311/tcm12的杂交组合F₂作为定位群体，共157株，最终将突变基因tcm12定位在ID21199和ID21436之间，其遗传距离分别为0.3 cM和0.8 cM，物理距离为237 kb。

图3 SSR分子标记RM519在两亲本之间的多态性以及在突变型F2代单株中的分离带型 Figure 3 The segregation of SSR marker RM519 in parents and F2 mutant individuals

图4 水稻温敏感失绿基因tcm12在第12号染色体上的位置 Figure 4 Position of tcm12 on rice chromosome 12

表2 新发展的分子标记的引物序列及多态性分析 Table 2 Primer sequence and polymorphism of new developed molecular markers between parents

2讨论
叶绿体是植物进行光合作用的场所。因此，研究叶绿体发育的分子遗传机理一直是植物遗传学和分子生物学研究领域的热点。利用叶色突变体是研究水稻叶绿体发育的理想试验材料。据不完全统计，已报道的水稻叶色突变基因有77个，其中包括白化12个、黄化14个、转绿型14个、黄绿6个、浅绿3个、亮绿1个等(陈青等, 2010)，这些突变基因分布在除水稻第12号以外的染色体上(黄晓群等, 2005; Kurata et al., 2005; 陈青等, 2010)。但近年来有一些温敏感叶色失绿水稻突变体的报道正在逐渐增加，如S9040 (吴跃进等, 1991, 安徽农业科学, 47(1): 1-3)、Fan5 (Dong et al., 1994)、W4、W11、W17、W25 (舒庆尧等，1996)、7436S (Dong et al., 2001)、tsl-1 (陈佳颖等, 2010)和tsc(t) (祁鲁等, 2010)。这些温敏感叶色失绿水稻突变体中，如S9040、Fan5、7436S、W17、W25、tsl-1和tsc(t)都是低温表现为失绿，其中，tsl-1和tsc(t)的失绿复绿临界温度分别为27.5℃和22.5℃，而W4和W11是高温失绿。虽然突变体tcm12表型与同来源和突变方式相同的tsl-1和tsc(t)类似，但tsl-1和tsc(t)基因分别位于在第1号(陈佳颖等, 2010)和第3号(祁鲁等, 2010)染色体上，而tcm12定位在第12号染色体上。由此可见，即使相同来源相同突变方式的突变体，其突变基因和作用机制都不尽相同。本文将突变基因tcm12定位在ID21199和ID21436之间的237 kb，跨越4个BAC (AL713943, AL713950, AL731732和AL731737)克隆群，目前该区域尚未发现与叶绿体发育相关候选预测基因，说明tcm1基因是一个新的水稻温敏感叶色失绿突变基因。

导致植物叶色失绿的因素很多，其中，叶绿体的发育是关键之一。本研究对tcm12突变体的叶绿体结构观察初步表明，其叶色失绿的原因是由低温条件造成叶绿体发育障碍所致(图2)。近来，水稻叶绿体发育的分子机制取得了一些进展(赵剑等, 2011)。Kusumi等(2010)将水稻叶绿体发育在分子水平上分为3个时期：(1)与叶绿体发育和分裂相关的基因(如OsPOLP1和FtsZ)大量表达；(2)依赖核基因编码的RNA聚合酶(NEP)转录的质体编码的RNA聚合酶(PEP)基因，如OsRpoTp、v2和rpoA等基因大量表达；(3)与光合作用相关的核编码和质体编码的基因大量表达。在对低温(20℃)白色，高温(30℃)正常的v1突变体的研究中，在低温下其RNA聚合酶表达延迟导致其他质体基因(psbA, rbcL和16SrDNA)表达量下调，叶绿体不能正常发育(Kusumi et al., 1997)；而对与v1的表型相似的v2突变体的研究表明，是一种编码鸟苷酸激酶突变，抑制了叶绿体分化的早期质体遗传系统中质体转录本的翻译，使叶绿体发育停滞在第1时期(Sugimoto et al., 2004)；而对在恒定的20℃或30℃时表现为白化，在交替的温度下为正常的v3突变体的研究表明，V3编码的核糖核酸还原酶RNR活性不足，影响了与质体发育相关的基因表达，导致叶绿体发育阻滞(Yoo et al., 2009)。本研究的突变体tcm12的叶绿体在低温下能够正常分裂，但不能形成完全成熟的内部结构，高温下叶绿体发育完全，与野生型无明显差异，由此推测可能受温度调控的TCM12是在叶绿体发育的第2期起作用，但这些有待进一步验证。今后，在此基础上在目标基因区域内发展更多新的分子标记和扩大定位群体，希望能进一步缩小预测基因的范围，为今后该基因的克隆和功能研究打下基础。

3材料与方法
3.1材料
水稻温敏失绿突变体(thermo-sensitive chlorosis mutant, tcm12) tcm12是粳稻嘉花1号(Oryza sativa L. SPP japonica)经⁶⁰Co γ射线辐照处理后产生的M₂代群体后代。该突变体已在上海，海南两地经过多次自交繁殖和选择，各农艺性状均保持稳定。

3.2突变体苗期叶色观察
为研究突变体tcm12的叶色变化与温度的关系，将tcm12及其野生型嘉花1号的种子放在20℃条件下催芽4 d，随后挑选芽长一致的种子分别播种在装有水稻栽培土的培养盒内，分别放置于四个不同温度(20℃, 24℃, 28℃和32℃)的光照培养箱(GXZ智能型, 宁波江南仪器厂)中培养，每天光照12 h，光照强度为180 μmol/m²•s。观察各温度下水稻幼苗叶色变化，直至突变体叶色转化到正常绿色为止。

3.3苗期叶绿体电镜观察
分别选取在20℃和32℃温度下生长的突变体tcm12及其野生型嘉花1号幼苗的第三叶，选取突变体tcm12第3叶失绿部位以及相同部位野生型的绿色部分，首先用2.5%戊二醛和1%锇酸4℃固定，经磷酸缓冲液漂洗后，依次于50%、70%、80%、95%和100%的乙醇和丙酮梯度脱水，然后用环氧树脂室温包埋过夜，60℃固化过夜，最后切片经3%醋酸铀-柠檬酸铅双染色后，用透射电镜(Hitachi765型)观察拍照。

3.4遗传分析和定位群体构建
将2008年和2009年种植在上海的突变体tcm12分别与广占63S、9311和嘉花1号杂交，得到F₁代。同年11月左右在海南省的浙江省农业科学院实验基地种植F₁代种子，得到F₂代。将F₂代种子于20℃条件下催芽5 d后, 播种在铺有湿润皱纹卫生纸的金属托盘内，置于光照培养箱中培养，温度设置为20℃，光照强度为180 μmol/m²•s，光照时间为12 h。10 d后，观察水稻幼苗叶色分离情况，并进行统计分析。另外，从F₂中挑选出叶色失绿表型的幼苗移至装有水稻营养液的培养盒内继续培养，用于DNA的提取。

3.5水稻DNA的提取
采用调整后的CTAB法(Murray and Thompson, 1980)提取亲本及广占63S/tcm12 F₂代定位群体的水稻植株基因组DNA。而9311/tcm12 F₂代定位群体水稻植株基因组DNA的提取参照王兰等(2009)的方法进行。

3.6突变体基因定位
本研究采用本实验室保存的SSR和InDel分子标记引物(陈佳颖等, 2010; 祁鲁等, 2010; 李超等, 2010)，共81对。选出突变体tcm12和广占63S之间有多态性的分子标记引物后，在广占63S/tcm12的F₂代群体中随机挑选24株突变体表型的单株，以确定与突变基因连锁的染色体。随后扩大广占63S/tcm12和9311/tcm12的F₂代定位群体数量，利用由浙江大学开发的SSR分子标记(www.dnaresearch.oxfordjournals.org)以及利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上公布的日本晴和9311的序列设计InDel分子标记，验证多态性后用于进一步定位突变基因。PCR反应体系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL、1×dNTP 1 μL、Taq酶0.5 μL、ddH₂0 18 μL、10×上游引物1 μL、10×下游引物1 μL、模版DNA 1 μL。在PCR仪(Eppendorf)上进行扩增，引物序列由上海生工合成。PCR反应程序：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s (退火温度随分子标记变化)，72℃延伸35 s，35个循环；72℃总延伸7 min。PCR产物置于2.0%~2.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上电泳检测后直接在UVP凝胶成像仪上拍照，并保存图片。

3.7连锁分析
将上述成像图片中同突变体亲本带型一致的单株记做“A”，与另一亲本带型一致的单株记做“B”，与F1带型一致的单株记做“H”，带型不清楚的单株记做“-”，将电泳图谱转换成数据群，利用MAP- MAKER/EXP 3.0软件(Lincoln et al., 1992, http://www.plantsciences.ucdavis.edu/bit150/2009/09_dn_labs/lab-7/09_lab7.pdf)对转换后的数据群进行连锁分析并计算出遗传距离。

作者贡献
梅杰、苏倩倩和张建辉是本研究的试验设计和试验研究的执行人；梅杰完成试验设计、数据分析和论文撰写；苏倩倩和张建辉参与试验设计，试验结果分析；董彦君和林冬枝是项目的构思者和负责人，指导试验设计，数据分析，论文写作与修改；叶胜海和张小明是项目的构思者。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(30971552)、上海市科委项目(09DJ1400505,0939191200, 10DZ2271800，12ZR1422000)以及上海市教委项目(J50401)资助。作者感谢上海中科院植物生理生态研究所滕胜课题组在本实验过程中的帮助。

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