风信子是百合科(Liliaceae)风信子属(Hyacinth)的球根花卉，原产于地中海和南非(义鸣放, 2001, 中国农业大学出版社, pp.104)。花期早、花序端庄，花色丰富，具有浓郁的芳香气味，可以片植于花坛、花境、花丛及疏林边和草地，具有浓厚的春天气息，鳞茎水养，放置书桌、案头，新奇别致，是春季重要的观赏植物。国内目前对风信子的研究多集中在组织培养(吕燕波等, 1998; 刘勇刚和徐子勤, 2001; 车生泉和王彩波, 2003)、繁殖(熊瑜和史益敏, 2007; 罗凤霞等, 2008; 孙莉莉等, 2008)、栽培(韩鹰等, 2005; 杜方和丁永强, 2006; 熊瑜, 2007; 刘建敏等, 2007, 北方园艺, 3: 124-126)、花粉及病毒检测(周秀涛等, 1996; 胥婧等, 2007)等方面，关于风信子分子标记的研究报导还未见报道。

ISSR分子标记技术是基于PCR技术发展起来的，其反应结果主要受到Taq DNA聚合酶、引物、模板、Mg²⁺、dNTPs等五种因素的影响。本研究以风信子基因组DNA为模板对ISSR-PCR反应体系进行优化，旨在获得适合风信子ISSR-PCR反应的最优体系，并以此体系对110条引物进行筛选，为进一步开展风信子分子标记研究提供技术支撑。

1结果与分析
1.1风信子ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化
1.1.1 Mg²⁺浓度对ISSR-PCR反应的影响
Mg²⁺浓度对反应的特异性和PCR的效率影响都较大(刘维全等, 2009, 化学工业出版社, pp.104-106)，它不仅影响Taq DNA聚合酶的活性，还会与dNTP、模板、引物结合，影响模板与引物的结合效率、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性以及引物二聚体的形成(曹冬梅等, 2011; 林万明, 1993, 人民军医出版社, pp.7-14)。本研究设置8个体积梯度，从图1中可以看出当Mg²⁺体积在2.0~1.2 μL时均能获得较多的条带，但体积为1.4 μL时，条带清晰，亮度也较高，且重复性较好；当Mg²⁺体积小于1.2 μL时，扩增谱带缺失，由此可知，风信子ISSR-PCR反应的最佳Mg²⁺浓度为1.4 μL。

图1 Mg2+浓度对ISSR-PCR反应的影响 Figure 1 Effect of Mg2+ centration on ISSR-PCR reaction

1.1.2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响
dNTPs的质量和浓度与PCR的扩增效率有着密切的关系。dNTPs是PCR反应的原始材料。dNTPs浓度过高，会导致聚合酶错误掺入，产生非特异性扩增产物，过低则会造成扩增产物量少。如图2所示，本研究所设置的dNTPs体积梯度范围内均能扩增出条带，当体积为3.0~2.2 μL范围内时条带较清晰，当体积为1.5 μL时扩增条带最多，且经重复实验确定较为稳定，体积为1.0 μL时由于浓度过低，扩增条带缺失且背景比较模糊，故最佳dNTPs体积为1.5 μL。

图2 dNTPs浓度对ISSR-PCR反应的影响 Figure 2 Effect of dNTPs concentrations on ISSR-PCR reaction

1.1.3 DNA模板浓度对ISSR-PCR反应的影响
从图3中可以看出风信子ISSR-PCR反应对DNA模板浓度要求范围较为宽泛，这与庞赫等(2010)、潘丽梅等(2009)等人的研究结果一致。当模板体积在2~0.6 μL的范围内时扩增条带基本一致，当体积为0.4 μL时，扩增条带较少，背景相对也较模糊，从节约实验材料考虑，选择模板体积为1.0 μL。

图3 DNA模板浓度对ISSR-PCR反应的影响 Figure 3 Effect of DNA template concentrations on ISSR-PCR reaction

1.1.4引物浓度对ISSR-PCR反应的影响
引物是PCR特异性反应的关键，浓度太低，扩增产量少，浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机率(曹冬梅等, 2011; 姜荣波, 2011; 林万明, 1993, 人民军医出版社, pp.7-14)。本研究中(图4)引物体积为1.8~1.0 μL时，扩增条带清晰，并且体积为1.5 μL时，条带最亮；当体积在2.4~2.0 μL时，扩增不完全，当体积为0.8 μL时主带缺失，条带较为模糊，因此，本实验选择1.5 μL作为最优体积。

图4 引物浓度对ISSR-PCR反应的影响 Figure 4 Effect of Primer concentrations on ISSR-PCR reactio

1.1.5 Taq DNA聚合酶对ISSR-PCR反应的影响
Taq DNA聚合酶对PCR反应有直接影响，其使用量过低时，可能会导致扩增条带缺失甚至扩增失败，但其使用量过高时，不仅造成经济上的浪费，还有可能导致非靶序列的扩增。根据图5的扩增结果可以看出，0.1~0.5 μL的5 U/μL Taq DNA聚合酶均可以扩增出条带，但0.4 μL和0.5 μL扩增的条带相对较弱一些，经重复试验确定，0.2 μL的5 U/μL Taq DNA聚合酶扩增产物最为稳定，因此选择0.2 μL的5 U/μL Taq DNA聚合酶作为风信子ISSR-PCR最优体积。

图5 Taq酶浓度对ISSR-PCR反应的影响 Figure5 Effect of Taq polymerase concentrations on ISSR-PCR reaction

1.2 ISSR引物的筛选与扩增
根据以上优化条件反复试验，最终确立适合风信子ISSR-PCR扩增的反应体系，即20 μL的总反应体积，包括2.0 μL 10×Buffer、1.4 μL 25 mmol/L Mg²⁺、1.5 μL 2.5 mmol/L dNTPs、1.5 μL 10 pmol/μL引物、0.2 μL 5 U/μL Taq聚合酶、1.0 μL 30 ng/μL DNA模板，最后用双蒸水补足体积。并用此体系筛选加拿大哥伦比亚大学公布的引物序列及日本MasumiYamgaihsi等人在百合研究中所采用的3A ISSR引物序列，共110条引物。经过初筛和复筛(图6; 图7)获得12条扩增条带清晰，重复性好，多态性高的风信子ISSR引物(表1)。

图6 部分引物初筛结果 Figure 6 ISSR profile of prescreening against sample

图7 4份模板对部分引物复筛的结果 Figure 7 ISSR profile of several primers against four samples DNA templates

表1 筛选出的风信子ISSR引物 Table 1 Selection of ISSR Primer in Hyacinthus

2讨论
实验结果表明：Mg²⁺浓度、dNTPs浓度、引物浓度及Taq酶的量对扩增影响较大，浓度过高或过低时常导致背景弥散或条带缺失；DNA模板浓度对扩增影响较小，在设置的浓度范围内条带变化不大。在试验设计中DNA模板没有去除降解的RNA，但对ISSR-PCR扩增并没有影响，说明ISSR-PCR扩增对DNA模板质量要求并不是太高。

参照胡凤荣等(2011)、姜荣波(2011)、曹冬梅等(2011)等人相关研究，本研究扩增程序采用TD-PCR，结果表明TD-PCR可以很好的应用于风信子扩增程序。最终得到风信子ISSR-PCR扩增体系为：即20 μL的总反应体积，包括2 μL 10×Buffer、1.4 μL 25 mmol/L Mg²⁺、1.5 μL 2.5 mmol/L dNTP、1.5 μL 10 pmol/μL引物、0.2 μL 5 U/μL Taq聚合酶、1 μL 30 ng/μL模板DNA，最后用双蒸水补足体积。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性40 s，54℃退火45 s，72℃延伸90 s，3个循环；94℃变性40 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，10个循环；94℃变性40 s，51℃退火45 s，72℃延伸90 s，20个循环；94℃变性40 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，20个循环；72℃延伸8 min，最后4℃保存。

ISSR是一种基于PCR的分子标记技术，其原理与RAPD相似，但可以检测到更高的种间遗传差异，稳定性亦较高(邢志兵, 2009; 潘丽梅等, 2009; 高山等, 2010)，其反应体系也受反应条件、扩增程序及物种的影响，本研究采用与风信子同科的岷江百合PCR扩增的最优反应体系作为该实验的原初扩增体系，避免了一定的盲目性。在原初扩增体系的基础上对各个因素进行优化，筛选出最优反应体系和引物，用以进行30个风信子品种的ISSR分子标记研究及其杂种后代鉴定。

3材料与方法
3.1实验材料与试剂
本研究供试的风信子种球购自荷兰，先取其嫩叶，用70%酒精对叶片表面消毒，用纯净水冲洗干净，然后置于-70℃冰箱中保存备用。dNTPs、Mg²⁺、10×Buffer (Mg²⁺ Free)、Taq DNA聚合酶、ISSR引物、DNA Marker (DL100)，均于上海赛百盛生物工程有限公司购买。

3.2实验方法
3.2.1基因组DNA的提取
DNA的提取采取简易CTAB法(胡凤荣等, 2011)，DNA质量检测采用0.8%琼脂糖电泳，DNA纯度和浓度测定使用U-008OD核酸测定仪，DNA浓度稀释至最终30 ng/μL。

3.2.2 ISSR-PCR反应条件优化设计
参考相关文献(周凌瑜等, 2008; 邓明文等, 2007; 胡凤荣等, 2011)，将该实验的原初扩增反应体系定为20 μL，包括10×PCR Buffer 2 μL、25 mmol/L Mg²⁺ 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、10 pmol/μL引物1 μL、5 U/μL Taq聚合酶0.1 μL、30 ng/μL模板2 μL，最后用双蒸水补足体积。在此基础上，对DNA扩增中5个参数进行体积梯度设置(余艳等, 2003; 罗欣等,2010) (表2)，并用引物UBC807和UBC834进行最优条件的筛选，每个梯度实验至少重复3次，直至实验结果稳定。用最优体系，一个模板对110条ISSR引物进行初步筛选，再用3~4个模板进行复筛，将扩增条带清晰，多态性好，重复性好的引物用于风信子的扩增。

表2 ISSR-PCR反应体系各成分优化试验设计(20 μL) Table 2 Optimum design of components for ISSR-PCR reaction (20 μL)

3.2.3 ISSR-PCR扩增
参照胡凤荣等(2011)、姜荣波(2011)、曹冬梅等(2011)等人的相关研究，在杭州朗基MG96+PCR仪上扩增，扩增程序采用Touch-Down-PCR (降落PCR)，即94℃预变性5 min；94℃变性40 s，54℃退火45 s，72℃延伸90 s，3个循环；94℃变性40 s，52℃退火45 s，72℃延伸90 s，10个循环；94℃变性40 s，51℃退火45 s，72℃延伸90 s，20个循环；94℃变性40 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，20个循环，最后72℃延伸8 min，最后4℃保存。

3.2.4反应产物的电泳与检测
使用2%琼脂糖胶goldview染色，在电压不超过5 V/cm的电场强度下，1×TAE缓冲液中，电泳90 min，黑马凝胶成像系统上观察成像。

3.3引物的筛选
利用上述的PCR优化条件，随机选择一种样品作为DNA模板，按照多态性高、条带清晰、重复性好的原则对110条引物进行初筛，再用3~4个样品对筛选好的引物进行复筛，选出最终适用引物。

作者贡献
任翠、鲍仁蕾是本研究的实验设计和实验研究的主要执行人；王斐、王志强完成数据分析，论文初稿的写作；王斐、王志强参与实验设计及实验研究；胡凤荣是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作，确定修改及定稿。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由中国博士后科学基金面上项目(20100470217)和江苏省高校优势学科建设工程项目共同资助。

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