线粒体是真核细胞进行能量代谢的一种重要细胞器，在细胞新陈代谢和生物能量转换中处于中心地位。近年来研究表明，线粒体基因组还是一种重要的细胞核外基因组，与植物细胞质雄性不育有关，是细胞质雄性不育基因的载体(Boeshore et al., 1983; 1985)，其分子内或分子间频繁重组所形成的异常嵌合基因是细胞质雄性不育产生的分子基础。此外，花药与植物细胞质雄性不育息息相关，而且花药线粒体较黄化苗线粒体能更好反应不育基因的表达(王学德, 2000)。所以，建立高效提取高纯度且完整的花药线粒体的方法是进行线粒体细胞质雄性不育分子生物学研究的必要途径。目前分离纯化线粒体大多是从黄化苗或愈伤组织，利用差速离心法，差速离心结合蔗糖衬垫法、或结合蔗糖密度梯度、或结合氯化铯密度梯度超速离心法等，但这些方法各有优缺点(唐群等, 2005; 谭才邓, 2007; 李文强等, 2007; 王巍敏等, 2008; 赵杨等, 2011; Leroy et al., 1985; Scotti et al., 2001, 刘建利, 2008, 北方园艺, (12): 153-154),如差速离心结合密度梯度超速离心法对设备要求高且实验成本昂贵，而差速离心以及差速离心结合蔗糖衬垫法等获得的线粒体纯度较低，完整性不能保证，并且所提取线粒体DNA (mtDNA)纯度低，易降解，易被污染(李文强等, 2007)。

宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)是我国著名的药食两用中药材，阐明其雄性不育机理，是科学利用其不育性状进行杂交育种的有效途径。而研究宁夏枸杞花药线粒体基因组，阐明花药线粒体基因表达及蛋白调控系统是揭示枸杞细胞质雄性不育分子机制的重要途径。但目前尚无宁夏枸杞花药线粒体的分离提取方法。为了获得高质量的枸杞花药线粒体，本研究建立了一种简捷、高效、经济的差速离心分离纯化枸杞花药线粒体的方法。经过细胞学和分子生物学手段的检测鉴定，证明本方法获得的线粒体不仅纯度高、质量好，而且得率也很高。本方法的建立为枸杞花药线粒体基因组等相关分子生物学研究奠定了可靠的实验基础。

1 结果与分析
1.1本方法获得的花药线粒体活性强、结构完整，并且纯度与得率高
采用本差速离心法获得的纯化线粒体用1% Jannus Green B染色后，高倍显微镜下观察发现，线粒体颗粒均匀，没有其它异形颗粒杂质污染，且都被染成蓝色(图1A)。油镜下，线粒体呈蓝绿色，并且在镜下跳动移动很活跃，其中不少线粒体还处于分裂之中，形成念珠状多个线粒体聚集体(图1B)。表明本法分离出的线粒体纯度高，活性很强。将该线粒体通过透射电镜法制样后，在透射电镜下观察，线粒体纯度仍然很高(图2A)，并且结构完整(图2B)。经称重计算，通过本差数离心法平均每克花药可提取纯化线粒体约144 mg，说明由本法获得的线粒体得率很可观。

图1 光学显微镜下的纯化线粒体 Figure 1 The purified mitochondria under the optical microscope

图2 透射电镜下的纯化线粒体 Figure 2 The purified mitochondria under the electron microscope

1.2由纯化线粒体裂解而来的mtDNA的结构完整，纯度高，且浓度与得率都较高
为了进一步检测由本法提取的线粒体质量，本研究又运用分子生物学手段验证由线粒体裂解的mtDNA质量。本研究将经过DNaseⅠ消化和未经DNaseⅠ消化的2种线粒体提取的mtDNA用紫外分光光度计测定分析，结果二者的A260/A280平均在1.80~1.85之间，A260/A230平均为2.23，结果均符合DNA样品要求。表明由本线粒体获得的mtDNA样品纯度高，无蛋白质或酚类污染。并且2种样品mtDNA的平均浓度为0.31 μg/μL，每克花药可平均提取mtDNA 36.2 μg。而一般由黄化苗提取mtDNA时，平均每克黄化苗可提取的mtDNA没有超过30 μg。此外，本研究将该2种样品的mtDNA经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示其mtDNA条带都很清晰、完整，没有明显降解现象(图3)。上述结果表明，由本法提取纯化的线粒体裂解而来的mtDNA得率较高，结构完整，进一步说明本法获得的线粒体质量好。

图3 2种线粒体的mtDNA琼脂糖电泳图 Figure 3 The agarose gel electrophoresis patterns of the mtDNA of two kinds of mitochondria

由于利用花药提取mtDNA最主要的污染源是核DNA，为了检测由本法提纯线粒体得到的mtDNA是否是真正的mtDNA，以及是否存在核基因组的污染，本研究又对上述2种mtDNA用线粒体基因rrn26S (550 bp)特异引物和核基因actin (230 bp)特异引物进行PCR扩增。结果未经DNaseⅠ消化的线粒体其mtDNA中除了扩增出rrn26S特异性条带外，还扩增出一条很弱的核actin特异性条带；而经过DNaseⅠ消化的线粒体其mtDNA中只扩增出一条rrn26S特异性条带(图4)。由此说明，用本差速离心法获得的线粒体中含有很少量的核DNA污染，但是，将线粒体经过DNaseⅠ消化处理后，可以获得无核基因污染的高纯度线粒体以及高纯度的mtDNA，并且该mtDNA经过线粒体特异引物PCR扩增确证是mtDNA。

图4 mtDNA经核与线粒体特异引物PCR扩增电泳图 Figure 4 The agarose gel electrophoresis patterns of the mtDNA by specific primers of nucleus and mitochondria PCR amplificating

2讨论
2.1线粒体分离纯化方法
差速离心法分离线粒体是目前采用较普遍的方法，通过反复多次高、低速变速离心来达到分离纯化线粒体的目的。但是，本研究按照刘建利(刘建利, 2008, 北方园艺, (12): 153-154)几种差速离心法(谭才邓, 2007; 唐群等, 2005; 李振兴等, 2011; 黎冬华等, 2011)分离花药线粒体时发现，获得的线粒体不仅存在杂质较多，而且完整性差。本研究认为这种现象与离心力的选择和高离心力反复多次离心有关。鉴于枸杞花药富含多糖、多酚，易氧化形成棕色胶状复合物，而添加蔗糖的缓冲溶液因蔗糖很难洗脱干净而造成粘度大等状况，本研究在调整缓冲液成分基础上，通过选择合适的离心力，减少离心次数，经过反复摸索，最后确定了本差速离心法。经过细胞学与分子生物学手段的双重验证，表明该差速离心法分离花药线粒体技术可靠。与目前多种线粒体分离纯化方法比较，本差速离心法操作简单，减少了离心步骤，降低了纯化线粒体的离心力，这不仅缩短了提纯线粒体的时间，而且还大大提高了线粒体的质量，并且本法对药品、仪器要求较低，使用常规药品与分子生物学实验仪器即可满足实验要求。此外，由本差速离心法提纯的线粒体裂解而来的mtDNA得率远远高于现行的分离方法(王巍敏等, 2008; 李文强等, 2007; 赵杨等, 2011; 黎冬华等, 2011)。

2.2线粒体检测方法
Jannus Green B是线粒体的专一性活体染色剂，能与线粒体中细胞色素氧化酶结合，从而将具有完整结构的线粒体染成蓝绿色，而不能被染色的颗粒则为失去活性的线粒体或细胞质碎片，所以用于检测线粒体的活性、完整性及纯度。然而，本研究在提纯线粒体的研究过程中发现该显色反应特征既不典型，也非专属。高倍镜下Jannus Green B染色的线粒体呈深蓝色，油镜下呈蓝绿色，但是该蓝绿色可以因光强或焦距的不同而发生变化，似有色似无色，从而造成辨认困难。本研究曾使用其他多种试剂(如甲苯胺蓝, 甲基蓝等)染色，也表现出相同的显色反应结果。但是，本研究发现活体线粒体，在一定的时间范围内通过油镜观察，都可以观察到活跃的跳动移动活动这一特征。经过反复验证，本研究认为，单一通过Jannus Green B的显色反应不能够完全确认线粒体颗粒，应该将Jannus Green B的显色反应与活体线粒体的跳动特点一起作为线粒体及其活性强弱的基本检验指标较为可靠，且便于把握。在此基础上，进一步运用电镜手段检验其结构是否符合质量要求。本线粒体检测鉴定方法可以作为线粒体分离后的一种质量检验方法。有了高质量、高产率的线粒体，那么线粒体裂解提取mtDNA的纯度和得率等问题就能迎刃而解。

2.3线粒体电镜样品制作方法
线粒体由于颗粒很小、分散，不易于直接用常规电镜包埋的方法进行样品包埋。而目前线粒体电镜样品制作主要有琼脂糖包埋法和低速短时离心法(唐群等, 2005; 陈学军等, 2000)。本研究在比较了前人的琼脂糖包埋法和低速短时离心法之后，摸索出了一种更为便捷的、能够减少线粒体结构损伤的线粒体包埋制样的方法。本研究经过多次试验证明该方法效果很好，线粒体在透射电镜下观察结构完整，密度适中。与前人方法相比较，该方法既不用琼脂糖包埋线粒体，也不用离心机离心分离脱水剂等溶液，而是简单地应用普通摇床轻摇盛放线粒体的器皿，就可解决线粒体样品的溶液置换问题。本包埋法既避免了琼脂糖包埋过程中线粒体易损伤的弊端，也避免了由于离心造成的线粒体相互挤压而结构受损等难题。

3材料与方法
3.1试验材料及仪器
试验材料为宁夏枸杞(Lycium barbarum L.)花药，2012年夏季采自宁夏贺兰山东麓育新公司枸杞种植园。

试剂及仪器：所有生化及分子生物学试剂主要购自Sigma公司，引物由上海生工合成。低温高速离心机(TGL-16M)、低温高速离心机(CT15E/CT15RE, 日立)、DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)、Nanodrop超微量紫外可见分光光度仪(SMA4000)、Gel Doc XR型凝胶成像仪(BIO-RAD公司)、PCR仪(C1000 Thermal Cycler, BIO-RAD公司)、恒温水浴锅、超净工作台、Leica Ultracut R型超薄切片机(瑞士)、H-7650 (日本)透射电子显微镜及各种型号的离心管等常规仪器和用品。

线粒体抽提缓冲液(PH 7.5)：500 mmol/L蔗糖，50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L EDTA-Na₂2H₂O，0.2% (w/v) BSA，5 mmol/L半胱氨酸，0.3% (v/v) β-巯基乙醇(用时临时加入)，2% (w/v) PVP-40 (用时临时加入)。

3.2方法
3.2.1花蕾采集与花药获得
于2012年7-8月清晨，根据四分体发育早期花蕾的形态学特征，多人采摘花蕾并迅速放入冰盒的青霉素小瓶中带回实验室。将青霉素小瓶内的花蕾倒在冰盘上后，多人快速剥离出所需花药，并且放入含有5 mL预冷的线粒体抽提缓冲液并且置于冰浴中的研钵里。将每200粒花蕾剥离出的花药(约0.428 g)为一个处理置于一个研钵中。

3.2.2差速离心获得纯化线粒体
下述操作步骤如无特别说明均在4℃以下或者冰浴中进行。

将上述研钵中的花药在冰浴中进行中速充分研磨(2 min左右)后，把匀浆液倒入4层尼龙纱上(每层100目)，并过滤到50 mL的离心管内(该离心管放置于冰浴中)。然后将研钵放回到冰浴中，并且在研钵内，用10 mL预冷的线粒体抽提缓冲液冲洗尼龙纱上的花药残渣，并将花药残渣液拢回到研钵底部，继续中速研磨1 min左右。然后将此匀浆液按上述方法过滤，滤液合入前次滤液中。与前述方法一样，再用10 mL预冷的线粒体抽提缓冲液洗涤尼龙纱上的花药残渣。再次在研钵中研磨花药残渣，同样的方法过滤，滤液合并入前2次滤液内。之后将含有3次滤液的50 mL离心管于４℃、750×ｇ离心10 min。取4/5上清液置于一新预冷的50 mL离心管。将此离心管于４℃、9 000×ｇ离心20 min后，弃去上清液，留下沉淀。再用预冷的线粒体抽提缓冲液，用枪头轻轻吹打悬浮管内的沉淀。之后将此离心管以４℃、9 000×g离心10 min，弃上清，所得沉淀即为纯化线粒体。最后对每个离心管内的纯化线粒体沉淀进行称重。

3.2.3线粒体活性、纯度及完整性检测
Jannus Green B染色法  将分离获得的线粒体用1% Jannus Green B应用液按1:1比例混匀，室温染色10 min后，在日本Olympus光学显微镜下观察检测线粒体的活性、纯度与完整性。

透射电镜法  将1管线粒体沉淀用适量预冷的线粒体抽提缓冲液悬浮后转移至1.5 mL离心管中，低速短时离心后，弃去上清液，然后用二甲胂酸钠缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.0)配制的2.5%戊二醛前固定液于4℃固定2 h，洗涤液洗涤2次，每次15 min。1%锇酸后固定液4℃固定2 h或过夜，洗涤液洗涤2次，每次15 min。之后经30%丙酮、50%丙酮、70%丙酮、80%丙酮、90%丙酮和3次纯丙酮进行系列梯度脱水，每级10 min。最后在spurr树脂中渗透与包埋。spurr树脂渗透过程中，先经不完全树脂：丙酮(1:1)渗透12~16 h，然后转入包埋胶囊用完全树脂渗透1 d，再更换新鲜的完全树脂再渗透1 d，最后70℃聚合8 h。线粒体制样过程中溶液的置换可根据每级处理时间，在即将处理结束或整个处理过程中把含有线粒体的离心管置于摇床上轻缓地振动，使线粒体自然下沉到管底，然后吸干上清液更换下一级溶液。线粒体包埋块在Leica Ultracut R型超薄切片机上进行超薄切片。切片厚度70 nm。超薄切片经醋酸双氧铀-柠檬酸铅双重染色，在日本H-7650透射电子显微镜下观察与CCD拍照。

3.2.4线粒体DNaseⅠ消化处理
向1管线粒体沉淀中加入5 μL DNaseⅠ (1 U/μL)，10×Buffer 10 μL，超纯水85 μL，充分混匀后37℃温育1 h。然后加入10 μL 0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，混匀后静置10 min以终止反应。再向管内加入2 mL STB缓冲液(400 mmol/L蔗糖, 50 mmol/L Tris-HCl, 0.1% BSA, pH 8.0)，之后，将离心管于４℃、12 000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀即为无核等基因组污染的线粒体。将此线粒体保存于-80℃备用。

3.2.5线粒体DNA提取
采用CTAB法，将经过DNaseⅠ消化处理和未经DNaseⅠ消化处理的2管线粒体分别置入2 mL离心管。然后2个离心管均进行以下处理：加入800 μL 2×CTAB提取液，60℃预热30 min，期间混匀2~3次。然后加10 μL RnaseA 10 mg/mL，室温放置10 min；再加800 μL氯仿：异戊醇(24:1)，混合均匀。离心管经12 000 r/min离心15 min后，取上清(约750 μL)到一新的2 mL离心管。再在该新离心管中加入1.5倍体积1×CTAB提取液后放置20~30 min；离心管再次12 000 r/min离心15 min，弃上清，留沉淀并将沉淀晾干。将沉淀溶于200 μL灭菌ddH₂O，然后加2倍体积的95%乙醇，20 μL醋酸钠(3 mol/L)。将该离心管于-20℃沉淀1 h后，于4℃，12 000 r/min离心15 min，弃上清，留沉淀。再向沉淀中加500 μL 75%乙醇洗涤沉淀，之后将离心管于12 000 r/min，离心10 min，弃上清，沉淀中加50 μL灭菌ddH2O溶解，即得到mtDNA。将此mtDNA于-20℃保存。

3.2.6 mtDNA完整性、质量及浓度检测
琼脂糖凝胶电泳检测：分别取上述2种mtDNA样品1 μL和9 μL上样缓冲液混匀，用0.8%琼脂糖凝胶电泳，100 V，45 min左右，通过凝胶成像系统拍照检测mtDNA的完整性，RNA污染等情况。
紫外分光光度法检测：分别取上述2种mtDNA样品5 μL，加超纯水稀释100倍，经紫外可见分光光度仪测定其A260/A280、A260/A230及mtDNA浓度，并进行纯度分析。

3.2.7 mtDNA纯度PCR扩增检测
根据NCBI数据库中的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计了线粒体基因rrn26的特异引物(上游5'-TTTTCAAGTGTCAGTAGCGG-3'; 下游5'-TTGACTATGACAAGAGTCGC-3’)和核基因组actin的特异引物(上游5'-ATGGCCGATGGTGAGGACATTC-3'; 下游5'-GGTGCGACCACCTTGATCTTC-3')，引物由上海生物工程公司合成。以经DNaseⅠ消化的线粒体提取的mtDNA和未经DNaseⅠ消化的线粒体提取的mtDNA为模板，进行PCR扩增，进行mtDNA的确认和检测其mtDNA中是否存在核DNA污染。

50 μL的PCR反应体系中含有模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL (10 μmol/L)，2×EcoTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH₂O 21 μL。PCR循环：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min (30 cycles)，最后72℃延伸5 min。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳检测。

作者贡献
林佳和尹晓雯是本研究的实验设计和实验研究的执行人；林佳、尹晓雯和章英才完成数据分析，论文初稿的写作；郑蕊参与实验设计，实验结果分析；徐青是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(编号: 31060162; 30960208)项目资助。感谢宁夏育新公司在本实验过程中提供了大量试验材料以及宁夏大学生命科学学院的同事在实验过程中提供的无私帮助。

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