苦瓜(Momordica charantia L.)是葫芦科苦瓜属的一个栽培种，以鲜食嫩瓜为主，为我国和东南亚各国夏季重要的瓜类蔬菜之一。苦瓜果实采收后极易发生快速软化，果肉变黄，并很快腐烂的现象，是造成产销损失的最大因素。因此，延缓苦瓜果实成熟软化，延长苦瓜货架期，是苦瓜生产中亟须解决的问题。苦瓜属于跃变晚峰型果实，乙烯可能在诱导和促进苦瓜成熟软化中起主导作用(夏向东, 1999; 颉敏华等, 2004)。前人研究表明果实成熟软化是经一系列相关酶有序调节而实现的，涉及众多基因的协同作用(朱明月等, 2004; Payasi et al., 2009; Thumdee et al., 2010)。但苦瓜遗传分子基础研究很少，其成熟软化的分子调控机制仍不清楚，只有少数的乙烯合成和信号转导的若干基因从苦瓜中分离出来(张唐维等, 1995; 李念颖和杜宜殷, 2007; 蔡幸君和杜宜殷, 2008; 林生华和杜宜殷, 2008)。

全长cDNA文库的构建、测序和功能注释是了解生物体结构和功能的重要手段。但是常规cDNA文库中不同基因的拷贝数存在着巨大差异，干扰了基因筛选的效率，增加了发掘低拷贝数基因的难度。均一化cDNA文库技术克服了基因转录水平上差异给文库筛选和分析带来的障碍，使不同丰度的基因的拷贝数趋于均一，提高随机测序的有效性，是一种高效率、低成本的发现新基因重要方法之一，并展现了良好的应用前景(李晨等, 2010; 王卓等, 2011; Ke et al., 2011; Marques and Perez-Amador, 2012; Sha et al., 2012)。笔者拟以强雌性系苦瓜1/4黄期果实为材料，整合SMARTTM技术和DSN均一化技术，构建成熟软化期苦瓜果实cDNA文库，通过对文库进行EST测序及分析，以期筛选出与苦瓜果实成熟软化相关基因，克隆和研究其功能，为在分子水平上解析揭示苦瓜果实成熟软化分子机理奠定基础。

1结果与分析
1.1 总RNA提取
经琼脂糖电泳检测可以看出，提取苦瓜果实总RNA28S 和18S两条带清晰，亮度比例约为2:1无降解情况且没有DNA和蛋白污染(图1A)。经微量紫外分光光度计测定，所提取RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.92，OD₂₆₀/OD₂₃₀为2.01，表明提取苦瓜果实总RNA纯度和完整性可以满足cDNA文库构建的需要。

图1 苦瓜果实总RNA 琼脂糖电泳检测(A), 未经均一化cDNA (B)和1/2 U的DSN处理的cDNA (C) Figure 1 Total RNA extraction from bitter gourd fruit (A), non- normalized cDNA (B), cDNA treated by 1/2 DSN (C)

1.2 全长cDNA的合成
LA-PCR扩增反转录得到的cDNA，电泳检测显示扩增片段在500~3 000 bp之间，cDNA中含有若干亮带(图1B)，表明cDNA文库中的高丰度基因，并且不同大小和丰度的mRNA都得到了有效的反转录和扩增。

1.3全长cDNA文库均一化效果检测
未经均一化cDNA分别用0、1/4 U和1/2 U DSN处理、筛选最佳循环数，接着2次PCR扩增，电泳检测表明(图1C)，采用1/2 U的DSN处理和15个循环数扩增后，发现cDNA从1 kb至3 kb中间较亮的条带消失，呈现均匀的弥散条带，表明高丰度基因得到了有效地均一化处理，满足均一化cDNA文库的构建要求。

1.4文库质量鉴定
经计算，构建的苦瓜果实的为3 600 000个菌落/µL连接产物，取适量扩增文库稀释并涂板进行蓝白斑筛选，并用质粒PCR验证，结果表明文库重组率约为98.0%。以M13R和M13F为上下游引物，随机挑取24个单克隆进行PCR扩增与电泳检测，片段大小集中在750~2 000 bp之间，平均插入片段长度大于1.4 kb (图2)。

图2 cDNA文库插入片段大小检测 Figure 2 The PCR production of cDNA clones at random from cDNA library

1.5 EST测序结果分析
对文库中的768个克隆进行了5′端测序，将载体序列、污染序列和小于100 bp 序列利用cross-match软件去除，获得684条有效序列，EST平均长度为726 bp，其中超过500 bp以上的634条，达到87.3%。利用Phrap软件进行拼接，共获得607个unigene，其中包括45个序列组成17个contig和562个singleton，重叠范围2~4个，文库冗余率为7.41%，显示整个文库有较高的非冗余性。对unigene进行全长率预测，有67%的克隆推测有ATG起始密码子，表明构建的cDNA文库全长率较高，与黄瓜的基因库进行同源性比对发现，同源性达88.9%。

利用Gene Ontology对607个unigenes进行功能注释，共获得2 365个GO terms。这些序列在生物过程、细胞组件和分子功能3个功能类型中，分别占43.0%、37.0%和20.0%。其中具有分子功能有465个uningenes，约占unigene 总数的76.6%，共分成11个功能类别(图3)。其中催化活性和结合活性的相关基因比例较高，分别达到27.96%和24.3%。转录调节活性、转运活性和酶调控活性的相关基因含量，分别为9.46%、8.17%和5.81%。此外，还有分子传感活性5.59%、结构分子活性5.38%、电子载体活性4.3%、转录调节活性3.87%、抗氧化活性3.0%和辅助转运蛋白活2.15%。

图3 苦瓜果实表达基因的go功能分类 Figure 3 Clusters of orthologous of the bitter gourd furit genes

通过进一步分析，发现一些可能与苦瓜果实成熟软化相关基因。表1列出了部分可能与果实成熟软化相关基因的名称和序列号。有参与胞内蛋白质降解的E2和E3；与果实软化与细胞壁代谢有关的β-galactosidase；参与乙烯合成的LOX、ACO和ACS；与乙烯信号传导有关的基因EIN3、ERF、ERT和MAPK；与抗逆相关的PRO和APX等基因。

表1 苦瓜果实均一化全长cDNA文库中可能与软化相关基因  Table 1 The genes related to fruit softening in normalized full-length cDNA library of Momordica charantia L. fruit

2讨论
制备高质量总RNA是成功构建cDNA文库的前提，必须保证RNA高纯度且无降解。苦瓜1/4黄期果实中含糖量高，由于多糖的存在抑制了多种酶的活性，不利于反转录和多步PCR 扩增，本试验在RNA沉淀时加入5 mol NaCl高浓度盐离子使多糖悬浮在溶液中，获得高质量的RNA沉淀，检测表明本研究改良Trizol法提取的总RNA 的质量满足建库的要求。

逆转录cDNA第1、2链的数量和质量是影响全长cDNA文库质量的另一个重要因素。本研究采用两步法逆转录替代SMART kit中的反转录过程，提高逆转录效率和全长cDNA第一链的比例，保证了cDNA第1链的合成质量。

本研究采用DSN消化处理，特异降解在复性过程中的双链cDNA和DNA-RNA杂交体中的DNA，降低了高丰度与低丰度cDNA的比例，提高低丰度基因的拷贝数，使不同丰度基因的拷贝数趋于均一化，增加了筛选到稀有基因的可能性本试验原始文库的库容3 600 000个菌落/µL连接产物，文库重组率约为98%，播入片段平均长度1.4 kb，保证了文库的完整性与覆盖度；均一化处理后，高丰度基因的亮带消失，呈现出一条均匀的弥散条带，经测序冗余率为7.41%，67%EST有ATG起始密码子，显示均一化效果比效理想。结果表明构建的均一化cDNA文库具有较高的质量。

本研究克隆出若干个与胞内蛋白质降解、细胞壁代谢乙烯合成、信号传导和抗逆等可能与苦瓜果实成熟软化相关的新基因。因此，成熟软化期苦瓜果实均一化全长cDNA文库构建，对于发掘新基因是十分经济和有效的，可作为苦瓜果实成熟相关基因的研究提供了一个良好的试验平台。

3材料与方法
3.1 材料
所用材料为苦瓜强雌性系24-K (Momordica charantia L. Gynoecious Line, 24-K)，由福州市蔬菜科学研究所苦瓜课题组提供。苦瓜经人工自交授粉18 d后，采收无病虫害及机械损伤果实，放入人工气候箱中，置25℃，贮藏1~5 d。当果实至1/4黄期，瓜顶端色由翠绿色转色为浅黄间绿，转色面积达1/4果面时，切成0.5~0.8 cm3的小块，液氮速冻，置于-80℃超低温冰箱备用。

3.2 苦瓜果实总RNA的提取
改良Trizol RNA提取试剂盒(Invitr ogen)方法，将苦瓜果实组织随液氮冷冻并充分研磨呈粉末状，经Trizol提取，接着先后用酚氯仿、氯仿萃取。取上清液，以体积比为：上清液:异丙醇:5 mol NaCl=4:3:3比例，加入异丙醇和5 mol NaCl，充分混匀，冰上静置15 min，以12 000 g在4℃离心15 min将RNA沉淀，经70%酒精洗2次后，于室温风干。然后将RNA溶于DEPC水中。最后用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用紫外分光光度计检测RNA的浓度、纯度。

3.3 全长cDNA的合成与纯化
将随机取样10份提取的苦瓜果实总RNA等量混合后，采用赖燕(2011)两步法逆转录法，合成cDNA第一链，在逆转录产物中加入2/3体积的5 mol乙酸铵和3倍体积的无水乙醇，-20℃过夜沉淀后，在4℃、12 000 g离心30 min；弃上清，将沉淀用75%乙醇洗2次，4℃、8 000 g离心10 min，弃上清，晾干沉淀。将沉淀产物溶于20 μL TE(pH8.0)中；cDNA第二链的合成参考郑鸿昌(2012)的方法进行，第二链cDNA的产物使用半透膜(Spectrum, Cat. No.132117)进行纯化回收。

3.4 全长cDNA的均一化处理
改进Trimmer-Director Kit (Evrogen, Cat. No.NK002)的方法，将双链cDNA经过95℃变性3 min，68℃杂交6 hr后，分别用0、1/4 U、1/2 U和1 U的DSN (duplex-specific nuclease)处理，采用郑鸿昌(2012)方法进行LA-PCR扩增，确定最佳的DSN处理浓度与最佳循环数，以最佳DSN处理的产物为模板，进行均一化全长cDNA的大量扩增。

3.5 均一化全长cDNA文库质量的检测
将均一化cDNA经Sfi酶切后，电泳检测，切取酶切产物1 kb以上片段，经半透膜回收后，与pBlueScriptⅡ-SfiI载体(Bio S&T Inc.俞长河博士提供)连接，参考郑鸿昌(2012)的方法脱盐处理，采用电激转化法，将连接产物转化至DH10B感受态细胞中。经细菌培养，获得苦瓜果实基因的初级全长cDNA文库菌液，在文库菌液中加入甘油至终浓度为20%。将文库菌液经液氮速冻后，置-80℃冰箱中保存。

取10 μL初级文库细菌原液，稀释至1 000倍，从中取50 μL稀释液涂布含卡那霉素抗性的LB平板培养，计算菌落总数和蓝白菌落数，计算转化效率和重组率，挑取24个阳性克隆，进行菌落PCR检测，计算插入片段大小。

3.6 测序与EST比对分析
挑取768个含插入片段的克隆，置装有80 μL 15%甘油的frozen medium的2个384孔板中，委托为上海MAP生物技术有限公司测序。对所获得的序列去载体和接头，并进行拼接。对获得的EST序列进行BLAST比对，E-value<1.0E-10为有显著同源，提取注释信息，参照注释结果与黄瓜基因组数据库中Csativus_122_cds.fa、Csativus_122_annotation_info (http://www.phytozome.net/cucumber.ph)和WEGO (http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego)进行比对与功能分类。计算重组率和全长比例分析。

作者贡献
高山是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成论文初稿的写作；许端祥负责论文的修改及校对；陈贵信是本研究的实验技术指导；林义章和潘东明是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由福建省重大专项“苦瓜商业化育种技术体系建设”(2012NZ0003-4)资助。本论文部分试验在福建农林大学作物学院何水林教授试验室完成，并得到何水林教授悉心指导，特此致谢。

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