查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS, EC2.3.1.74)是植物合成类黄酮类物质的第一个关键酶，它的主要作用就是在丙二酰辅酶A参与下，将4-香豆酰辅酶A催化产生苯基苯乙烯酮(Koes et al., 1994; Martin, 1993)。先前的研究发现，查尔酮合成酶不仅催化黄酮类物质的合成，而且在植物花青素合成、植物根瘤形成、抵御生物胁迫(抗病, 抗虫)以及防UV伤害等方面都具有重要的作用。如前人研究发现两种病菌(软腐病菌和灰霉菌)均能诱导小立碗藓查尔酮合成酶基因的表达，从而增强其抵抗病菌的能力(De León et al., 2007)。Courtney-Gutterson等人(1994)通过转基因的方法证实了CHS是影响花青素积累的一个关键酶基因。Pang等人(2005)分别用UV-B和伤害分别处理银杏叶片，显著诱导了CHS的表达。

最近，番茄基因组测序的完成将为全面分析番茄CHS基因提供了机遇(The Tomato Genome Consortium, 2012)。本研究在番茄全基因组信息的基础上，利用生物信息学方法鉴定了CHS基因家族的成员数目，分析其基因结构特征，如一些重要氨基酸残基的保守特性以及内含子-外显子结构；进一步利用番茄基因组信息对CHS基因进行染色体定位；最后利用番茄的基因芯片数据，分析CHS基因的在不同条件下的表达模式，为揭示番茄CHS基因家族成员的功能分析奠定理论基础。

1结果与分析
1.1番茄查尔酮合成酶基因家族成员的鉴定
为了鉴定番茄查尔酮合成酶基因家族成员，利用关键词“chalcone synthase”搜索番茄基因组数据库(http://solgenomics.net/和http://mips.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/searchjsp/index.jsp)。共鉴定出8个番茄查尔酮合成酶基因，分别命名为SlCHS01~SlCHS08。这些基因的长度为513 bp (Solyc06g043130) ~1 317 bp (Solyc12g098090)之间；分子量介于17.60 (Solyc06g043130) ~48.28 (Solyc12g098090)之间；理论等电点位于5.49 (Solyc01g111070) ~8.58 (Solyc12g098090)之间(表1)。

表1 番茄查尔酮合成酶家族基因 Table 1 Chalcone synthase family genes in tomato

1.2番茄查尔酮合成酶基因家族成员的遗传多样性分析
为了进一步分析番茄查尔酮合成酶基因家族成员之间的遗传多样性，我们分别对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比较分析(表2)。从表2中可以看出，在核苷酸水平上，番茄查尔酮合成酶家族基因之间相似性水平在42.9%-84.0%之间，相似性最低的是SlCHS05和SlCHS06，而最高为SlCHS04和SlCHS07；在氨基酸水平上，相似性水平在16.7%~92.0%之间，相似性最低的为SlCHS05和SlCHS06，最高为SlCHS04和SlCHS07。

表2 番茄查尔酮合成酶家族基因的氨基酸和核苷酸序列相似性 Table 2 Similarty of nucleotide and amino acid sequence of chalcone synthase family genes in tomato

1.3番茄查尔酮合成酶蛋白保守结构域比对
为揭示番茄查尔酮合成酶蛋白结构域的保守程度以及锌指结构特征，对这些转录因子的结构域进行多序列比对(图1)。结果显示，除SlCHS05和SlCHS06分别在N端和C端发生了缺失外，剩下的6个查尔酮合成酶基因均具有较高的保守性。另外，构成番茄查尔酮合成酶蛋白催化中心的活性位点(Cys¹⁶⁴, His³⁰³和Asn³³⁶) (Ferrer et al., 1999)、决定底物特异性苯丙氨基酸残基(Phe²¹⁵和Phe²⁶⁵) (Jez et al., 2002)及信号序列(G378FGPG) (Kim et al., 2002)都是保守的。

图1 番茄查尔酮合成酶蛋白的氨基酸序列比对 Figure 1 The multiple sequence alignment of tomato chalcone synthase proteins

1.4番茄查尔酮合成酶基因染色体定位
根据番茄基因组测序的基因组信息，分析8个查尔酮合成酶基因在染色体的分布情况(图2)。发现这些基因仅分布在番茄5条染色体上，分别为1、5、6、9和12号染色体。其中9号和12号染色体含有一个查尔酮合成酶基因，1号、5号和6号含有两个查尔酮合成酶基因。除了6号染色体上两个查尔酮合成酶基因位于染色体中部之外，其余的查尔酮合成酶基因均位于各个染色体的末端。

图2 番茄查尔酮合成酶基因染色体分布 Figure 2 Distribution of chalcone synthase genes in tomato chromosomes

1.5番茄查尔酮合成酶基因系统发育关系及结构特征分析
根据查尔酮合成酶蛋白氨基酸序列，运用软件MEGA5.0构建了番茄查尔酮合成酶蛋白的系统发育树(图3A)。如图所示，番茄查尔酮合成酶基因可以明显的分为两大类，第一类包括6个查尔酮合成酶基因，分别为SlCHS03~SlCHS08，占整个查尔酮合成酶基因的75%。第二类包括2个查尔酮合成酶基因，分别为SlCHS01和SlCHS02。此外，利用番茄基因组数据库提供的查尔酮合成酶基因基因组序列和核苷酸序列，绘制了它们的基因结构模式图(图3B)。所有的查尔酮合成酶基因含有较少的内含子(0~2个)，SlCHS03、SlCHS04和SlCHS07含有1个内含子，SlCHS01、SlCHS02和SlCHS08含有2个内含子，SlCHS05和SlCHS06基因无内含子。

图3 番茄查尔酮合成酶基因的聚类及内含子-外显子结构分析 Figure 3 Phylogenetic analysis and intron/exon configurations of chalcone synthase genes in tomatos

2讨论
植物基因组测序的完成加速了其基因组学以及功能基因组学的研究，使得科学研究者在该平台上发掘一些重要的基因变得更加便捷。在植物大规模测序以后，生物信息学的研究地位变得越来越突显，特别在分子标记的开发、基因分离、基因注释等方面发挥着重要的作用。番茄是世界上重要的一种蔬菜，2012年5月，番茄基因组已经测序完成(The Tomato Genome Consortium, 2012)，这为在全基因组水平上分析番茄重要基因提供了机遇。植物中第一个查尔酮合成酶基因是从荷兰芹中克隆的(Reimold et al., 1983)。到目前为止，已经从许多植物中克隆得到查尔酮合成酶基因，但在番茄中还未见报道。本研究从番茄基因组数据库中共鉴定了8个查尔酮合成酶基因家族成员，核苷酸水平上相似性为42.9%~84.0%，氨基酸水平上为33.7%~92.0%，表明了番茄查尔酮合成酶基因家族成员之间具有高度遗传多样性，这些基因家族成员的多样化也为深入研究查尔酮合成酶基因的功能提供了一个很好的体系。

 此外，在双子叶植物中查尔酮合成酶基因家族数目较多，如菜豆基因组中发现了8个查尔酮合成酶的基因(Ryder et al., 1987)，矮牵牛中发现8个以上的查尔酮合成酶基因(Koes et al., 1989)，在两色蜀黍中已经分离获得了7个查尔酮合成酶基因，而大多数单子叶植物只含有2个查尔酮合成酶基因(Durbin et al., 2000)。因此，我们认为不同植物中编码查尔酮合成酶基因的数目是不同的，而且这些基因在单子叶植物和双子叶植物分化之前就已经存在。番茄中查尔酮合成酶基因家族成员的鉴定为我们进一步分析其功能奠定了基础。

3材料和方法
3.1材料
番茄查尔酮合成酶相关信息主要来自两个数据库，包括http://solgenomics.net/和http://mips.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/searchjsp/index.jsp。

3.2番茄查尔酮合成酶基因的鉴定、基因结构及其染色体分布分析
 为了全面的鉴定番茄查尔酮合成酶基因，应用关键词“chalcone synthase”在在数据库(http://solgenomics.net/和http://mips.helmholtz-muenchen.de/plant/tomato/searchjsp/index.jsp)中进行搜索，获得番茄查尔酮合成酶基因相关信息。然后通过PFAM网站(http://pfam.janelia.org/)进行鉴定。通过网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在线工具Gene Structure Display Server (GSDS)绘制查尔酮合成酶基因的外显子-内含子结构图。根据茄科基因组数据库中(http://solgenomics.net/)获得的查尔酮合成酶基因信息，利用软件MapDraw V2.1绘制查尔酮合成酶基因染色体分布图。

3.3序列比对及系统发育树的构建
通过软件Clustal X (Chenna et al., 2003)进行查尔酮合成酶蛋白多序列比对，利用MEGA 5.0 (Tamura et al., 2007)软件中的邻接法(Neighbor-Joining)对其氨基酸序列构建系统发育树，Bootstrap值设为1 000。

作者贡献
阮美颖和万红建是本研究的实验设计和实验研究的执行人；叶青静，王荣青、周国治和姚祝平参与实验设计，试验结果分析；俞锞，袁伟和刘云飞等参与论文写作与修改；杨悦俭是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31071800)、浙江省自然科学基金(LQ12C150020)、浙江省农业新品种选育重大科技专项(2012C12903)、国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-G-16)、浙江省公益技术研究农业项目(2011C22007)和浙江省蔬菜产业创新团队(2009R50026)的资助。

参考文献：
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