花器官作为被子植物重要的观赏器官，其形态具有多样性，花发育的ABCED模型很好的解释了花器官形成过程中各基因的互作，而大部分ABCDE基因都属于MADS-box基因(Schwarz-Sommer et al., 1990; Drews et al., 1991)，因此，MADS-box基因在花发育过程中起了关键作用。兰科属于世界四个特大科之一，花型独特、多样，是研究单子叶植物花发育基因的理想实验材料，目前，已从兰花中鉴定和分离了一些花发育相关的基因。Chang等(2009)从文心兰(OncidiumGower ‘Ramsey’)中分离了4个具有AP1/ AGL9功能的MADS-box基因OMADS6、OMADS7、OMADS10和OMADS11；徐小雁等(2011)分析了OMADS10和OAP3基因在文心兰各器官中的表达；Tsai等(2004)从蝴蝶兰(Phalaenopsisaphrodita)中分离鉴定得到4个B类功能基因PeMADS2、PeMADS3、PeMADS4和PeMADS5；郭滨等(2006)从蝴蝶兰中克隆到拟南芥PI基因的同源基因等，然而这些研究对于整个兰科家族还是比较有限。本研究以海南钻喙兰为材料，克隆获得两个花发育相关的MADS-box基因，为研究兰花家族花发育及进化提供更多数据。

1结果与分析
1.1海南钻喙兰中RgAP3和RgPI基因的克隆
利用RT-PCR分别获得了海南钻喙兰AP3和PI基因cDNA片段，根据所得片段设计RACE引物，获得两个基因的全长cDNA (图1)。BLAST比对结果表明，两基因分别与不同植物的AP3、PI基因有较高的同源性，因此命名为RgAP3和RgPI。

图1 RgAP3和RgPI基因全长cDNA序列PCR扩增产物电泳检测 注: M: DL2000 marker Figure 1 Agarose gel detection of the PCR products of full length genes of RgAP3 and RgPI Note: M: DL2000 marker

1.2 RgAP3和RgPI基因的序列分析
将获得的两个基因的核苷酸序列通过DNAUS- ER软件翻译成氨基酸序列并进行序列分析，结果显示RgAP3 cDNA全长968 bp，包含一个完整的编码225个氨基酸的开放阅读框；RgPI cDNA全长834 bp，包含一个完整的编码221个氨基酸的开放阅读框。两个基因均具有MADS-box基因家族所特有的MIKC，RgAP3的C末端具有一个YxxHDLRLA基序，其序列与铁皮石斛(Dendrobium oficinale) HdAP3-3 (ACD85095)，细茎石斛(Dendrobium moniliforme) DmAP3-4 (ADD60473)，兜兰(Paphiopedlum longifolium) PDEF (ACR16047)，鹤顶兰(Phaius tankerviliae) PtAP3-3 (ACD85120)的氨基酸序列同源性较高，分别达到96%、94%、94%和93%。RgPI的C末端具有一个MPM*FRVQP*QPNLQE基序(图2)，其序列与蝴蝶兰PPI-9 (AAV28175)，PPI-10 (AAV28490)和PPI-15 (AAV28491)，白拉索(Brassavolanodosa) BnPI (ACD85092)的氨基酸序列同源性较高，分别达到98%、98%、95%和97%。进化树也显示，RgAP3和RgPI分别属于B类MADS-box的AP3和PI分支，并与兰科其他植物的AP3和PI基因关系密切(图3)。

图2 所得基因推测的氨基酸序列与其他物种氨基酸序列对比 注: MADS-box结构域和K-box结构域, PI基序和AP3基序分别以黑线标出 Figure 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of RgAP3 and RgPI with other sequences Note: MADS-box domain, K-box domain, PI-drived motif and AP3-motif were markered with black line

图3 RgAP3及RgPI与其他B类MADS-box基因的系统进化树 注: 拟南芥AP3 (D21125); 拟南芥PI (D30807), 金鱼草DEF (X68831); 金鱼草GLO (X52023), 玉米ZMM18 (AJ292960); 玉米ZMM16 (AJ292959); 玉米ZMM29 (AJ292961), 蝴蝶兰PAP3 (AY771993); 蝴蝶兰PPI (AY748818); 蝴蝶兰PPI9 (AY748818), 六出花AlsDEF (AB267842); 六出花AlsGLO (AB267844), 鹤顶兰PtAP3 (ACD85120); 鹤顶兰PtPI (ACD85121), 细茎石斛DAP3 (ADD60473); 石斛DPI (ACD85096); 兜兰PlDEF (ACR16047); 文心兰OhPI (ACD85113); 百合LIGLO1 (DQ437527) Figure 3 Phylogenetic analysis of RgAP3 and RgPI with other B type MADS-box genes Note: Arabidopsis thaliana AP3 (D21125); Arabidopsis thaliana PI (D30807), Antirrhinum majus DEF (X68831); Antirrhinum majus GLO (X52023), Zea mays ZMM18 (AJ292960); Zea mays ZMM16 (AJ292959); Zea mays ZMM29 (AJ292961), Phalaenopsis amabilis PAP3 (AY771993); Phalaenopsis amabilis PPI (AY748818); Phalaenopsis amabilis PPI9 (AY748818), Alstroemeria ligtu subsp. AlsDEF (AB267842); Alstroemeria ligtu subsp. AlsGLO (AB267844), Phaius tankervilleae PtAP3 (ACD85120); Phaius tankervilleae PtPI (ACD85121), Dendrobium moniliforme DAP3 (ADD60473), Dendrobium hybrid cultivar DPI (ACD85096), Phragmipedium longifoliuml PlDEF (ACR16047), Oncidium hybrid cultivar OhPI (ACD85113), Lilium longiflorum LIGLO1 (DQ437527)

1.3 RgAP3和RgPI基因的组织表达特异性分析
利用半定量RT-PCR的方法，分别检测两个基因在植株不同器官及不同部位的表达情况。结果表明，两个基因仅在生殖器官中表达，而在营养器官中没有表达(图4)，其中RgAP3基因在花器官的各个部分均有表达，RgPI基因在花瓣及唇瓣中大量表达，在萼片中也有微量表达，而在花梗及子房中没有表达(图5)。表明两基因除了参与花瓣发育的调控外，可能与花器官其他部分的发育也有密切关系。

图4 RgAP3及RgPI在不同器官中的表达模式 Figure 4 Expression patterns of RgAP3 and RgPI in different organs

图5 RgAP3及RgPI在花器官不同部位的表达 Figure 5 Expression pattern of RgAP3 and RgPI in different parts of flower

2讨论
被子植物B类基因分为AP3和PI两个亚族，两者在C末端均具有一个PI基序，不同的是AP3亚族在其后还有一个AP3基序，而PI亚族在进化的过程这中丢失了这一基序。PI基序和AP3基序之间相互发生作用 (McGonigle et al., 1996)，调节花瓣和雄蕊的发育。两个基因的突变，均会影响花器官的正常发育。本研究从海南钻喙兰中获得的两个MADS-box基因，分别具有AP3和PI基因的特点，属于MADS-box基因家族中的B功能基因。

在经典的被子植物花发育的ABC模型中，B类基因的主要功能是调节花瓣及雄蕊的发育，而在不同的植物中B类基因的表达模式并不相同，特别是兰科植物，花结构较为复杂，萼片特化似花瓣，中间花瓣特化为唇瓣，雄蕊与雌蕊合成独特的合蕊柱，其表达模式更为多样(Hsu and Yang, 2002; Kanno et al., 2003; 2007)。蝴蝶兰OMADS5仅在萼片和花瓣中有表达(Chen and Chen, 2011)，PPI9在花器官的各个部分具有表达，而在营养器官中没有表达(郭滨等, 2006)，PhAP3在营养器官与生殖器官中均有表达(张浩等, 2010)，本研究克隆获得的海南钻喙兰RgAP3和RgPI基因仅在生殖器官中表达，而在营养器官中没有表达，这与其B类基因的功能吻合。RgAP3基因在花器官的各个部分均有表达，RgPI基因除在花瓣及唇瓣中大量表达，在萼片中也有微量表达，但在花梗及子房中没有表达，这些更进一步证实，B类基因的表达模式具有多样性，并且可能具有其他未知功能，还需对这些基因进行深入研究，才能更好的了解这些基因表达与植物花器官发育的关系。

系统进化表明，MADS-box基因家族中的B类基因相对于A类、C类基因，在进化上更为不保守，从而导致被子植物雄蕊和花瓣具有更丰富的多样性，B类基因进化速度比其他MADS-box基因快约20%~40% (Riechmann and Meuerowitz, 1997)，因此，其结构和功能的多样性可以反映植物的不同起源。兰科植物是植物界最大和进化程度最高的家族之一，花型独特且类型多样，本研究为进一步研究兰科植物的遗传进化关系提供了数据。

3材料与方法
3.1植物材料及菌种及载体
海南钻喙兰(Rhynchostylisgigantea)由中国热带农业科学院植物园提供。采集样品的根、叶及花器官(萼片, 花瓣, 唇瓣, 子房及花梗)并立即用液氮冷冻，于-80℃冰箱中保存。

大肠杆菌菌株为E. coli DH5α，由中国热带农业科学院品种与资源研究所快繁中心提供；PCR克隆载体为pMD-18T (TAKARA公司)。

3.2总RNA的提取及cDNA的合成
采用CTAB法，提取海南钻喙兰各部分总RNA，以5'-CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGC(T)₁₇为引物，使用Invitrogen公司反转录试剂盒(SuperScript^TM Ⅲ Reverse Transcriptase)合成cDNA，操作方法按试剂盒说明进行。

3.3基因的克隆与测序分析
根据MADS-box基因5'端保守序列设计简并引物：5'-GGGGTACCAA(C/T)(A/C)GICA(A/G)GTIACITA(T/C)TCIAAG(A/C)GI(A/C)G-3'，与反转录引物：5'-CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGC(T)₁₇，以花蕾cDNA为模板进行PCR扩增，获得MADS-box基因片段，反应条件为：95℃预变性12 min；95℃ 20 s，38℃ 30 s，72℃ 1 min，10个循环；95℃ 20 s，42℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环。根据AP3和PI基因3'端的特异性，分别设计2个基因的3'端特异引物作为内侧引物，(1) AP3特异引物：5'-CIAGICGIAG(A/G)TC(A/G)T-3'；(2) PI特异引物：5'-TGIA(A/G)(A/G)TTIGGITGIA(A/T)(T/G)GGITG-3'，分别与5'端引物5'-GGGGTACCAA(C/T)(A/C)GICA(A/G)GTIACITA(T/C)TCIAAG(A/C)GI(A/C)G-3'作为引物对，以第一次PCR产物为模板，进行PCR (反应条件同上)，分别获得海南钻喙兰AP3和PI基因片段。PCR产物经经琼脂糖凝胶电泳分析，回收，连接到pMD-18T载体上进行测序。根据所得序列按照SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit设计RACE引物，通过PCR方法获得全长。其中AP35，端外侧引物为GACACGAAAGGTCATTGGCATCT，内侧引物为TCATACTCCCTTCCATTGCCATT；PI 5，端外侧引物为ATCATGAGGAAGCGAAAAGAGAT，内侧引物为AGAACTGAGTGCGGAGATTGAT；反应程序根据SMA- RTTM RACE cDNA Amplification Kit说明进行。获得序列经琼脂糖凝胶电泳分析，回收，连接到pMD-18T载体上进行测序。拼接获得完整的cDNA序列，在NCBI上进行Blast对比，利用MEGA5.0软件进行系统进化树的构建。

3.4基因的表达分析
分别提取海南钻喙兰植株根、叶、花梗、萼片、花瓣、唇瓣、子房总RNA，反转录为cDNA (同2.1)，设计基因特异引物，以反转录产物为模板进行半定量RT-PCR.，以钻喙兰Actin基因为内标(表1)。反应程序为94℃预变性5 min；94℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 1 min，25个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表1 RT-PCR 引物 Table 1 Primes of RT-PCR

作者贡献
徐立和张俊芳是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成试验分析和论文初稿的写作；李志英参与实验设计，试验结果分析，数据分析和论文初稿的写作；徐立是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
 本研究由农业部重点实验室开放基金(KFKT2011-07)资助。作者感谢中国热带农业科学院提供实验材料。

参考文献
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