新疆是中国最大的产棉省区，得天独厚的光、热资源为棉花种植提供了便利条件。由于新疆地处西北内陆，常年降雨较少，并且耕地普遍有不同程度的沙化，与之伴随而来的盐碱化和次生盐碱化现象较为严重；此外常年连作造成了病虫害发生的日趋严重，极大地限制了新疆棉花种植业的发展。因此，生产上急需高产优质，同时兼具抗旱、耐盐碱和抗病虫害的棉花新品种，而通过常规的育种手段在短时间内是很难实现的。随着生物技术的快速发展，通过基因工程手段解决上述问题成为了可能。

要获得能够快速应用于生产的转基因棉花品种，选择合适的受体材料尤为关键，以农艺性状良好的推广品种做为受体材料最为理想。近年来组织培养技术日臻完善，许多棉花品种通过体细胞胚胎发生方式成功获得了再生植株(Wu et al., 2004; Sun et al., 2006; Jin et al., 2006; 周小凤等, 2007; 陈天子等, 2008; 周晶等, 2011)，但在新疆自育棉花品种中进行可再生品种的发掘工作仍有待进一步加强。另外，天然彩色棉种植是新疆棉花的一大特色，针对新疆本地彩棉品种进行再生体系研究较少(孟庆玉等, 2003, 中国棉花, 30(12): 8-9)。目前，所有转基因方法中以农杆菌介导的遗传转化方法最为可靠，且通过这种方法获得的转基因植株也最多，但它容易受到受体材料的基因型限制。因此，进一步扩大现有棉花品种可再生基因型和优化再生体系是十分必要的。

棉花通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的过程受多方面因素的影响，外源激素是除了基因型之外的一个重要因素。目前常用的外源激素主要有2,4-D、IBA和KT三种，一些学者的研究指出，在所有生长素和生长素类似物中，2,4-D对促进外植体愈伤组织的诱导具有比较好的效果(张献龙等, 1991; 王武和张献龙, 1992; Wu et al., 2004)，此外在悬浮培养时加入2,4-D有助于形成体细胞胚胎(Price and Smith, 1979)。关于IBA和KT的激素组合有利于胚性愈伤组织分化的结论多有报道(朱生伟和孙敬三, 2000, 科学通报, 45(9): 939-942; Wu et al., 2004; 李官德等, 2006; 孙京燕等, 2009)，并且对于一些难以诱导分化的顽拗品种也具有较好效果。本研究以新疆主栽白棉品种新陆早33号和绿棉品种新彩棉棉7号为研究对象，以2,4-D、IBA和KT为外源激素，通过比较不同激素组合对供试品种愈伤组织诱导和胚性愈伤组织分化的影响，建立和优化不同新疆棉花品种通过体细胞胚胎发生方式获得再生植株的体系，为进一步开展新疆棉花转基因育种工作奠定基础。

1结果与分析
1.1愈伤组织的诱导
从诱导愈伤组织的能力上来看，2,4-D+KT的激素组合明显优于IBA+KT。两个供试品种外植体接种于CIM-D1和CIM-D2培养基上5~7 d开始有愈伤组织长出，培养20 d后愈伤组织即能覆盖整个下胚轴段(图1A1)；而在IBA+KT激素组合的培养基上，外植体培养10 d左右才开始出现愈伤组织，培养30 d后仅在下胚轴的两端切口处形成愈伤组织(图1A2)，且部分愈伤组织状态较差，呈绿色或白绿色，且结构致密，较硬，并形成对下胚轴段切口的包被，此种情况下，难以再有疏松状态的愈伤组织形成(图1B)。

图1 棉花的体胚发生和植株再生 注: A1: 以2,4-D和KT为激素诱导出的愈伤组织; A2: 以IBA和KT为激素诱导出的愈伤组织; B: IBA和KT为激素诱导出的结构致密的愈伤组织; C1: 胚性愈伤组织形成初期; C2: 新彩棉7号的胚性愈伤组织及胚状体; C3: 新陆早33号的胚性愈伤组织及胚状体; D1: 子叶胚; D2: 炼苗; D3: 再生植株 Figure 1 Somatic embryogenesis and plant regeneration Note: A1: Calli induced on the medium with 2,4-D and KT; A2: Calli induced on the medium with IBA and KT; B: Compact calli induced on the medium with IBA and KT; C1: The early stage of embryogenic calli formation; C2: Embryogenic calli and somatic embryos of Xincaimian7; C3: Embryogenic calli and somatic embryos of Xinluzao33; D1: Cotyledonary embryos; D2: Domestication; D3: Regenerated plants

由统计结果分析可知(表1; 表2)，2,4-D+KT的激素组合均能有效诱导两供试品种外植体愈伤组织的形成，出愈率可达到100%，且愈伤组织增殖速度较快。对于新陆早33号而言，低浓度的2,4-D (0.05 mg/L)更有利于愈伤组织的增殖；而对于新彩棉7号，较高浓度的2,4-D (0.1 mg/L)有利于愈伤组织的生长。两个品种在IBA+KT的激素组合诱导下均能诱导出愈伤组织，但愈伤组织的诱导率和增殖量均处在较低水平。对于两个供试品种而言，随着激素浓度地下降，愈伤组织分化率和增殖量相应下降和减少。

表1 两个品种在不同CIM培养基上的出愈率 Table 1 Ratio of calli induction of two cotton cultivars on CIM medium

表2 不同激素组合对愈伤组织性状的影响 Table 2 Effect of the hormone combinations on calli characters

从各激素组合对愈伤组织生长状态的影响来看(表2)，2,4-D+KT的激素组合处理下两品种的愈伤组织为黄色和黄绿色，结构较为松软，外植体底部愈伤组织多呈稀泥状；2,4-D浓度较低时愈伤组织会随之较硬，颜色稍浅。IBA+KT的激素组合处理下两品种外植体均有数量不等的不定根形成，愈伤组织大致有两种状态：一种为半透明状，质地较软，淡黄色或黄白色，具有分化成为胚性愈伤组织的潜在能力；另一种结构致密较硬，呈深绿色，生长极缓慢，不具备分化成为胚性愈伤组织的能力。

1.2胚性愈伤组织的诱导
采用2,4-D+KT的激素组合并在继代过程中以调整2,4-D浓度由高至低的方式进行诱导，最早可使新陆早33号的外植体在培养两个月左右分化形成胚性愈伤组织；而在IBA和KT的激素组合处理下，虽均能使两供试品种分化形成胚性愈伤组织，但需要培养3个月左右才有胚性愈伤组织形成。培养4个月后，统计供试品种胚性愈伤组织分化情况(表3)。

表3 不同激素组合对胚性愈伤组织分化的影响 Table 3 Effect of the hormone combinations on embryogenic calli differentiation

不同激素组合对两个品种的胚性愈伤组织诱导效果有明显的差异。2,4-D+KT的激素组合虽然对愈伤组织的诱导和增殖具有明显地促进作用，但持续使用同种浓度激素进行继代培养很难诱导胚性愈伤组织产生。两个处理下新彩棉7号均未见分化，新陆早33号分化率分别为0和12.5%。新陆早33号外植体诱导培养过程中，2,4-D浓度减半后，继代培养两次左右即能分化出胚性愈伤组织，4个月后分化率可达到60.0%；而新彩棉7号分化率仅为7.5%，表明相同处理条件下不同基因型之间胚性愈伤组织分化率差异明显。IBA和KT的激素组合虽然对愈伤组织的诱导和增殖效果较差，但持续使用同种浓度激素对外植体进行继代培养却可以有效地诱导胚性愈伤组织分化。两种激素浓度分别由高到低的处理结果显示，新陆早33号和新彩棉7号胚性愈伤组织分化率表现出相应降低的趋势，表明一定范围内高浓度的激素组合更有利于胚性愈伤组织分化。

1.3胚性愈伤组织的继代和体细胞胚胎发生
观察发现，刚形成的胚性愈伤组织一般状态较差，多呈白褐色(图1C1)，新彩棉7号胚性愈伤组织仅在分化形成初期保持较松软的状态，需及早挑出进行单独培养，否则易变硬、褐化，极易枯萎死亡。因此，在分化期内，应勤于观察，及时将分化形成的胚性愈伤组织挑出接种于MSBP-1培养基进培养。新陆早33号的胚性愈伤组织则具有较强的活力，即使在胚性愈伤组织诱导培养基上仍能够持续增殖。

待胚性愈伤组织增殖一段时间后，将结构松散，无褐化和硬化结块的胚性愈伤组织挑至MSBP-2培养基上进行体细胞胚胎的诱导。新彩棉7号在MSBP-2培养基上继代培养3~4次便会有大量胚状体生成(图1C2)；而新陆早33号成胚能力相对较差，培养相同的时间只有零星的胚状体形成(图1C3)。但新彩棉7号分化出的胚状体发生白化、玻璃化的现象更为严重，针对这些问题可以通过适当缩短继代周期、或将胚状体移入不含激素的低盐浓度培养基(陈天子等, 2008)中进行培养等措施进行改善。

1.4植株再生
将发育良好的子叶胚移入MSBY培养基，将根部浅插入培养基中进行生根培养(图1D1)，根部发育良好的再生植株成长至3~5片真叶展开，即可进行适当水培炼苗(图1D2)，后移栽温室生长(图1D3)。

2讨论
于娅等(2004)研究发现，在棉花胚性愈伤组织诱导时2,4-D与KT配合使用能起到更好的效果，当2,4-D含量小于KT时，利于胚性愈伤组织的分化；同时，在诱导培养过程中2,4-D浓度由高骤低的处理也可以显著提高胚性愈伤组织的诱导率。本研究结果支持此结论，在诱导培养过程中对愈伤组织进行相似处理后，新陆早33号获得了较高的胚性愈伤组织分化率；但对于新彩棉7号的影响效果不明显。

经观察发现，2,4-D+KT激素组合诱导的愈伤组织与IBA+KT组合产生的愈伤组织在性状上具有很大的区别：前者正常状态下质地偏软，甚至呈稀泥状，出愈时间早，增殖速度快，且在继代培养过程中常伴随形成大量的疯长型愈伤组织(李官德等, 2006)；而后者形成的愈伤组织在正常状态下质地偏硬，呈半透明状，愈伤组织地增殖速度较慢并伴有侧根形成，且继代过程中常有深绿色，硬化的愈伤组织形成。张献龙等(1991)将棉花下胚轴外植体划分为中柱组织、形成层和形成层以外的皮层组织3部分，并指出愈伤组织和胚状体从形成层和皮层中发生，其余部位不产生或极少产生愈伤组织。此外，组织学观察表明，2,4-D+KT和IBA+KT处理中的体细胞胚胎发生模式不同，胚性愈伤组织分别起源于初生形成层和皮层细胞(朱华国等, 2012)。由此推测，可能是由于两种激素组合在诱导愈伤组织产生的的过程中脱分化形成愈伤组织的细胞位于下胚轴的不同部位，进而影响了胚性愈伤组织的诱导效果。另一方面，IBA+KT的激素组合虽然在诱导非愈伤组织产生和增殖等方面的能力较差，但在该激素组合处理下，均能有效诱导外植产生胚性愈伤组织，并且胚性愈伤组织的分化率与非胚性愈伤组织的出愈率和增殖量呈正相关。就供试品种而言，高浓度的IBA和KT的激素组合(1.0 mg/L, 0.5 mg/L)更有利于获得较高的胚性愈伤组织分化率。

能否获得高质量的胚性愈伤组织是棉花组织培养能否获得成功的关键(周小凤等, 2007)。经研究发现，激素的种类和浓度对愈伤组织的性状影响很大；此外，相同激素处理条件下愈伤组织的状态也会因基因型不同而有所差别。根据不同的研究对象选用适合的激素种类、浓度是决定实验成功的关键。本研究证实了DK处理和IK处理分别有利于新陆早33号和新彩棉7号的体细胞胚胎发生。此外，在胚性愈伤组织继代和诱导体细胞胚发生的过程中，于养基中添加谷氨酰胺和天冬酰胺，能有效缓解愈伤组织的褐化现象(陈妹幼等, 2002)并有助于体胚发生(Price and Smith, 1979)；此外，将发育良好的子叶期胚状体继代于以Phytagel为凝固剂的低盐培养基上进行培养(谢德意等, 2007)有助于再生苗的生根和正常发育。当再生植株的生根状态不够理想时，可以更换生根培养基进行1~2次继代，继代过程中将生长细弱或褐化的根系切除但要保留根的基部，这样就可以获得生长状态良好根系。

3材料与方法
3.1材料
棉花品种新陆早33号和新彩棉7号，由石河子大学棉花研究所保存并提供。

3.2方法
3.2.1无菌苗的获得
将棉籽去壳后，用0.1%的升汞消毒10 min，之后用无菌水清洗3~5次；将消毒后的种子接种于无菌苗培养基(1/2MS大量元素+15 g/L葡萄糖+6.5 g/L琼脂粉)，28℃暗培养5~6 d备用。

3.2.3愈伤组织的诱导
将无菌苗的下胚轴切成0.5~0.7 cm的小段，接种于愈伤组织诱导培养基(calli induction medium, CIM)。该培养基由基本培养基(MS无机盐+B5维生素, MSB)辅以多种组合的2,4-D、IBA和KT组成，设6个处理(表4)。各处理外植体诱导培养30 d后称重并计算单重，同时观察、记录愈伤组织性状。

表4 愈伤组织诱导培养基的组成 Table 4 Composition of CIM

3.2.4胚性愈伤组织的诱导和增殖培养
接种于CIM-D1上的外植体，在培养30 d后分出一半继代于CIM-D2培养基(CIM-D1-D2)，剩余一半仍按原方式培养。其余处理培养基成分不变，同样按原方式培养，进行胚性愈伤组织诱导，30 d继代一次，继续培养90 d后统计分化胚性愈伤组织的下胚轴数目。

将胚性愈伤组织继代于胚性愈伤增殖培养基(MSB+0.5 mg/L IBA+0.15 mg/L KT+0.5 g/L天冬酰胺+1.0 g/L谷氨酰胺, MSBP-1)进行增殖培养，15 d继代一次。

3.2.5体细胞胚胎的诱导和成苗
将黄色或淡黄色且结构松散的胚性愈伤组织继代于胚状体诱导培养基(主要成分与MSBP-1培养基相同，去掉NH₄NO₃，附加1.9 g/L的KNO3 (Trolinder and Goodin, 1987), MSBP-2)进行体细胞胚胎的诱导。15 d继代一次，继代两次后对成胚能力进行比较。

待体细胞胚胎萌发至子叶胚阶段，将之移入生根培养基(1/2MS大量元素+B5维生素+15 g/L葡萄糖+2.5 g/L Phytagel, MSBY)，进行生根培养至成苗。

愈伤组织的诱导分化及成苗过程均在(28±2)℃，光照16 h/d条件下进行。所用培养基pH值均调至6.0，于115℃灭菌20 min备用。

作者贡献
李鹏飞是实验研究的执行人，完成数据分析和论文初稿的写作；程文翰和王凡龙参与试验的执行；张新宇提供实验材料；朱华国和孙杰是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
 本研究由兵团种质资源创新与功能基因发掘利用专项(2012BB049)、农业部转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08005)和石河子大学动植物育种专项(gxjs2010-yz01)共同资助。

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