百合(Lilium spp.)是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)所有植物的总称，为重要的球根花卉(陈俊愉, 2000,中国林业出版社, pp.248)。其花形优美，品质高贵典雅，与月季、菊花、郁金香并列为世界4大切花。近20年来，百合跃居为荷兰第二大球根花卉，而国内百合生产种球大多依赖进口，种球费高居切花成本7成以上(刘华夏, 2009)。百合杂交育种工作开展缓慢主要是因为生长周期长，种间杂交困难。伴随着组织培养技术和分子标记技术的迅猛发展，使不具有亲和性的品种间杂交成为了可能，大大加快了百合育种速度(刘亚娟, 2009)。

本研究所用百合杂种是通过提前去雄、套袋授粉获得的，但胚拯救过程中胚乳或其它母体组织也有可能发育成苗，为了保证百合杂种后代的真实性，需要对其进行杂种鉴定。通过观察杂种后代的形态特征来进行，所需年限较长，受环境影响大。借助分子标记手段，可以在杂种幼苗进行早期鉴定，并且不受环境条件的影响，可快速可靠地确定其是否为真杂种。为确定杂种的真实性，本试验采用ISSR-PCR的方法对杂交育种获得的5个杂种进行杂种鉴定。

1结果与分析
1.1亲本及其杂种DNA提取
本研究用物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提供的步骤，提取的DNA电泳检测表明(图1)，DNA主带清晰明亮，无明显的拖尾现象，点样孔基本无滞留，获得高质量的DNA是后续工作顺利进行的有利保证。

图1 亲本及杂种DNA电泳鉴定 Figure 2 Electrophoresis result for DNA of parents and hybrids

1.2 ISSR-PCR扩增反应体系的建立
我们设计三种PCR试验方案对提取的‘Navona’的DNA进行PCR扩增，每种方案用两个引物3A02和3A31，每个引物进行4组重复。结果表明，试验方案2反应体系稳定，且扩增的条带较清晰，效果较好(图2)。

图2 三种ISSR-PCR扩增反应体系的建立 Figure 2 Banding patterns from ‘Navona’ with primers 3A02 and 3A31 using three ISSR-PCR systems

1.3特异ISSR引物对亲本及子代的PCR鉴定
采用试验方案2，分别用15种引物对所有的亲本和子代的DNA进行PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果表明引物3A19和3A20得到的条带比较清晰，并且条带较多(图3)，共计得到29条DNA条带，其中多态性条带24条，占总条带数的82.76%。

图3 引物3A19和引物3A20对所有亲本及子代的ISSR-PCR扩增结果 Figure 3 Banding patterns from all parents and hybrids with primer 3A19 and primer 3A30

利用扩增结果对亲本及杂种的亲缘关系进行分析，从表1及图3可以看出，引物(CT)₇AAA扩增出的‘Black Out’בLoreto’条带中有8条和两亲本共有，有2条与母本共有的特异条带，有1条与父本共有的特异条带，没有杂种特有条带；而在引物(CT)₇AGT中有6条和两亲本完全共有的条带，有2条与母本共有的特异条带，有2条与父本共有的特异条带，还有1条杂种特有条带，两个引物扩增的条带大部分与亲本相同，占总带数的63.64%。由此可见‘Black Out’בLoreto’杂种不仅具有单亲本带型和新带型，还有两个亲本的相加性带型。

表1 百合杂种ISSR的扩增带型及数量 Table 1 ISSR band pattern and numbers of Lily hybrids

引物(CT)₇AAA扩增出的‘Mount Duckling’自交的后代条带与亲本共有，无杂种特异条带出现，而引物(CT)₇AGT扩增的条带中有1条杂种特异条带，两个引物扩增的条带大部分与亲本共有，占总带数的92.86%。由此可见‘Mount Duckling’自交得到的杂种兼具亲本的带型和新带型。

引物(CT)₇AAA扩增出的‘Navona’בCheops’条带中有10条与两亲本共有，有2条与父本共有，无杂种特异条带出现；而引物(CT)₇AGT扩增的条带中有5条同两亲本，有1条同母本，1条同父本，并有1条杂种特有条带，两个引物扩增的条带大部分与亲本共有，占总带数的75%。总体上看，杂种‘Navona’בCheops’ 不仅具有单亲本带型和新带型，还有两个亲本的相加性带型，并且与父本共有的特异带型多于与母本共有特异性条带。

引物(CT)₇AAA扩增出的‘Navona’בDetroit’条带中有7条与两亲本共有，有2条与父本共有，无杂种特异条带出现；而引物(CT)₇AGT扩增的条带中有4条与两亲本共有，有1条与母本共有，1条与父本共有，并有2条杂种特有条带，两个引物扩增的条带大部分与亲本共有，占总带数的64.71%。总体上看，杂种‘Navona’בDetroit’ 不仅具有单亲本带型和新带型，还有两个亲本的相加性带型，并且与父本共有的特异带型多于与母本共有特异性条带。

引物(CT)₇AAA扩增出的‘Navona’בTresor’条带中有5条同两亲本，有1条与母本共有，有1条与父本共有，并有1条杂种特异条带出现；而引物(CT)₇AGT扩增的条带中有4条与两亲本共有，有3条与母本共有，1条与父本共有，并有1条杂种特有带，两个引物扩增的条带大部分与亲本共有，占总带数的52.94%。总体上看，杂种‘Navona’בTresor’仅具有单亲本带型和新带型，还有两个亲本的相加性带型，并且与母本共有的特异带型多于与父本共有特异性条带。

2讨论
获得百合杂种的同时，对所得的杂种苗进行早期鉴定对于百合新品种培育具有十分重要的意义。百合杂种幼苗从播种到开花需要3~5年，通过鉴定不仅能较早地剔除假杂种，以免造成不必要的浪费，还能较早地确定杂交的结果如何，为进一步育种工作的展开提供依据。一般只要杂种出现以下三种带型之一均可判断杂种的真实性：出现双亲各自的特异性条带，特别是父本的特异性条带；具有双亲特异性条带外，另有新带型的出现；显现双亲的加性带型(吴学尉, 2009)。如仅有母本带型，则是母体组织(如胚乳)发育而来的幼苗(史永忠, 1998; 卢圣栋, 1999)，可能为假杂种。

本研究所获得的杂交苗均为亚洲百合品系内品种杂交得来，利用ISSR分子标记对杂交苗的真实性进行鉴定。2条ISSR引物的PCR扩增和电泳结果显示，有的杂种与母本共有特异性带型多些；有的杂种与父本共有特异性带型多些，但分别都具有与母本共有的特异性带型和与父本共有的特异性带型，且以母本、父本及杂种子代三者共有带型占据大多数，一些杂种还出现了新带型。此外，杂种‘Navona’בCheops’，‘Navona’בDetroit’呈现出与父本共有的特异带型多于与母本共有特异性条带，这是否暗示其遗传性状更偏向于父本仍有待于进一步研究(谈晓林, 2011)。本实验杂交过程是在蕾期去雄、严格套袋情况下进行的，杂种苗与父本出现共有带，证明了5个杂种苗的真实性。

在人工记带时，遵循只记录易于辨认的条带的原则，所以ISSR所得到的多态性条带较少，如果用用更高的分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳代替琼脂糖电泳，将会得到更多的条带(杨本超, 2005)。而且由于ISSR为显性标记，使得某些现象还不能完全得以解释。杂种鉴定中形态学鉴定是最主要的手段，以ISSR分子标记作为形态学鉴定的辅助手段，可以在杂种苗期快速简便的鉴定。通过形态学与ISSR分子标记相结合对杂种进行鉴定, 在今后百合杂交育种中有广阔的应用前景。

3材料与方法
3.1植物材料及试剂
采集7个杂交亲本的幼嫩叶片以及5个杂交子代的组培苗叶片，若立即进行DNA的提取可放在室温下，若长时间保存，则经液氮处理后放入超低温冰箱保存。

图4 杂交亲本和子代 Figure 4 Crossing parents and hybrids

所用生物基因组DNA提取试剂盒、Taq DNA酶、dNTPs等购于天根生化科技(北京)有限公司，15条ISSR引物(表2)参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的序列由生工生物工程(上海)有限公司合成；琼脂糖为Promega公司生产，其他试剂均为国产分析纯。

表2 引物名称及序列 Table 2 Primers and sequences used in this research

3.2试验方法
3.2.1基因组DNA的提取和检测
主要参照植物基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提供的步骤，提取的DNA用50~100 μL无菌ddH₂O溶解。配置1%琼脂糖凝胶，5 μL DNA样品加l μL 6×Loading Buffer进行混样，于1×TBE缓冲液中在90 V的电压下电泳25 min，完成后将胶块放入的紫外凝胶成像仪(Bio Rad公司)成像并摄影。

3.2.2 ISSR-PCR分析反应体系建立
分别采用试验方案1 (李恩香等, 2008)、试验方案2 (姜福星, 2006)以及试验方案3 (Yamagishi et al., 2002)，筛选出最佳的ISSR-PCR反应体系进行试验，并从前人文献中的15个引物确定多态性较好的引物。

试验方案1 反应体系(25 μL)中各成分浓度：1×Buffer，MgCl₂ (2.0 mmol/L)，dNTPs (0.2 mmol/L)，Primer (0.4 μmol/L)，DNA (60 ng/25 μL)，Taq DNA polymerase (1.5 U)，剩下的体积用ddH₂O补足。

反应程序：94℃预变性5 min；40个循环(94℃变性50 s, 52℃ 45 s, 72℃延伸75 s)；循环结束后72℃延伸8 min；4℃保存。

试验方案2 反应体系(25 μL)中各成分浓度：1×Buffer，MgCl₂ (1.5 mmol/L)，dNTPs (0.3 mmol/L)，Prime (0.6 μmol/L)，DNA (60 ng/25 μL)，Taq DNA polymerase (0.5 U)，剩下的体积用ddH₂O补足。

反应程序：94℃预变性5 min；45个循环(94℃变性40 s, 52℃退火45 s, 72℃延伸90 s)；循环结束后72℃延伸8 min；4℃保存。

试验方案3 反应体系(25 μL)中各成分浓度：1×Buffer，MgCl₂ (3.0 mmol/L)，dNTPs (0.2 mmol/L)，Primer (0.2 μmol/L)，DNA (60 ng/25 μL)，Taq DNA polymerase (0.5 U)，剩下的体积用ddH₂O补足。

反应程序：94℃预变性5 min；30个循环(94℃变性1 min, 53℃退火3 min, 72℃延伸2 min)；循环结束后72℃延伸5 min；4℃保存。

3.2.3 PCR产物的变性及凝胶电泳分析
PCR扩增反应：分别对应上述PCR体系和相应的反应程序，以‘Navona’的DNA为模板，通过反复试验对比确定最佳的试验方案。本实验中采取了混合液加样的方法，即先将ddH₂O、引物、Mg^2＋、dNTP、Taq酶依次加入混合分装，再分别加入各DNA模板。

以所有的亲本和杂种的DNA为试验材料，利用筛选出的最佳PCR实验方案，分别用15条引物对其进行PCR扩增，筛选出最佳的引物。

凝胶电泳分析：将由最佳引物扩增出的产物进行电泳，用2%的琼脂糖凝胶电泳(含EB)，在1×TBE缓冲液中，120 V电压电泳80 min，在紫外凝胶成像系统上，利用Quantity One软件观察并照相、记录。每次试验重复3次。

作者贡献
管洁、焦雪辉和吴锦娣是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文的写作与修改；王青参与论文修改；吕英民是项目的构思者和负责人，指导实验设计。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家‘863’项目(2011AA100208)，国家自然科学基金项目(31071815和31272204)和教育部博士点基金项目(20110014110006)资助。作者感谢试验过程中北京林业大学黄河师兄和杜庆章师兄等人的指导。

参考文献
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