玻璃化法超低温保存生物材料是一门建立在超低温保存基础上的、简单易行的新兴保存方法，被认为是植物种质资源长期保存的可行方法。到目前为止，该技术已成功地保存了100余种植物材料。液氮冻存前的预培养、脱水、冷冻及解冻等处理均会对材料造成不同程度的胁迫，主要为渗透胁迫和低温胁迫。因此，整个超低温处理过程实质是一种逆境胁迫的过程。多项研究证明，此过程中的渗透胁迫，如PEG、甘露醇等，都能引发基因组DNA特异区段的甲基化(Tan, 2010; Labra et al., 2002)。

DNA甲基化以胞嘧啶甲基化为主具有表观遗传效应，可以导致基因表达、细胞分化和染色质失活等(Gonzalgo and Jones, 1997)。DNA甲基化不会引起基因碱基序列的改变，仅通过影响基因的表达使其功能发生改变。此类改变，可能遗传，也可能发生逆转(去甲基化) (洪柳和邓秀新, 2005)。DNA甲基化参与高等植物机体中的许多生物学过程，在基因的表达调控中扮演很重要的角色，同时对植物的生长发育进行调节(Meyer et al., 1994; Ulian et al., 1996; Rossi  et al., 1997; Mao et al., 2010)。

MSAP (methylation-sensitive amplified polymorp-hism)技术是在AFLP (amplified fragment length polymorphism)技术的基础上，结合使用甲基敏感性限制性内切酶(HapⅡ和MspⅠ)，检测基因组DNA的甲基化修饰水平及其其程度的变化。随着超低温技术保存种质资源研究的不断深入，该项技术已被广泛应用于检测生物材料超低温保存过程及其保存前后遗传变异方面的研究。应用MSAP技术对超低温保存后获得的木瓜再生植株进行甲基化状态检测后，发现超低温技术中的快速冻融过程是影响植物存活率和基因组甲基化变化的主要原因(Kaity et al., 2008)。何艳霞等(2009)研究超低温保存前后拟南芥幼苗DNA甲基化的变化，认为液氮冷冻会影响材料的甲基化状态，并且这种变化大部分是可以遗传的。

目前，有关马铃薯的玻璃化法超低温保存已有部分报道(Wang et al., 2006)，但从表观遗传学上研究超低温保存前、后马铃薯DNA甲基化遗传变化的报道却比较少。因此，本研究用玻璃化法对4个基因型的马铃薯茎尖进行保存，并采用MSAP技术检测超低温保存前后植株中DNA甲基化的变化情况，进而分析超低温保存对其遗传信息的影响，以期为马铃薯超低温保存技术研究提供理论基础，同时为其它生物材料的相关研究提供依据。

1结果与分析
1.1不同基因型马铃薯茎尖玻璃化法超低温保存分析
应用玻璃化法对4个马铃薯品种离体茎尖进行保存后，均能获得再生植株，成活率和再生率因基因型而异(表1)，并且不同基因型之间的差异显著。其中，‘青薯9号’的成活率和再生率最高，分别为86.93%和77.05%；‘E107’较低，成活率和再生率为65.82%和40.95%。

表1 不同基因型马铃薯超低温保存后的成活率和再生率 Table 1 Survival and regeneration rate of cryopreservation shoot tips from different genotypes potato

1.2 CCGG位点的甲基化水平分析
内切酶HpaⅡ和MspⅠ是一组同裂酶，能识别并切割CCGG序列。HpaⅡ对内、外侧胞嘧啶的甲基化极其敏感，即对^mCCGG，^mC^mCGG和C^mCGG都不能表现活性。MspⅠ仅对外部胞嘧啶的甲基化表现很敏感，可以切割C^mCGG，但不能切割^mCCGG和mC^mCGG。根据HpaⅡ和MspⅠ对CCGG位点甲基化敏感程度的不同，EcoRⅠ+HpaⅡ(记为M)和EcoRⅠ+ MspⅠ(记为H)酶切后的材料可能出现以下三种带型：Ⅰ型带，两种酶切组合H和M中均出现的带(图1中a所示)；Ⅱ型带，H酶切中不出现但在M中出现的带(图1b)；III型带，在H酶切中出现而在M中不出现的带(图1c)。

图1 4个基因型马铃薯MSAP图谱 Figure 1 MSAP finger-printing banding pattern of 4 genotype potatoes

本文对马铃薯茎尖超低温保存前后的DNA甲基化进行MSAP技术分析(表2)，结果表明：用16对引物组合进行扩增，平均扩增出493条带。其中，小白花的扩增带数最多，为531条；E107最少，扩增出439条。无论材料是否经过超低温保存，带型最多的都是I型带，其次为Ⅱ型带，Ⅲ型最少。超低温保存后，I型带最多的是E107，为303条；Ⅱ和Ⅲ型带最多的是小白花，分别为156条和103条。青薯9号发生甲基化变化程度较其他三个品种大，变异率为14.3%，其余在8%~14%之间。
 

表2 4个马铃薯品种的MSAP分析 Table 2 Analysis of methylation Polymorphisms of four Potatoes

1.3 CCGG位点甲基化模式变异分析
通过MSAP图谱分析4种马铃薯超低温保存前后的DNA甲基化模式及其程度的变化，将超低温保存前后材料CCGG位点的甲基化变异模式分为：(1)单态性位点，即同一CCGG位点在未作超低温处理和超低温处理后的甲基化模式相同；(2)多态性位点，即同一CCGG位点在未作超低温处理和超低温处理后表现不一致。根据材料超低温保存前后的数据显示，青薯9号、大西洋、小白花、E107的单态性位点分别为472、496、483和481条，分别占所有甲基化位点的85.7%、86.5%、88.6%和91.6%，说明超低温保存前后材料的大部分CCGG甲基化位点均可进行稳定遗传。

青薯9号、大西洋、小白花、E107超低温保存前后的多态性位点分别为79、73、64和44个，变化模式如表3所示：T1~T2甲基化的程度没有变化，但甲基化的位点发生变化；D1~D5表现为去甲基化，且甲基化程度下降；同时D1~D3表现为对照的甲基化经过处理后全为去甲基化，而D4~D5为对照双链完全甲基化经过超低温保存后为不完全去甲基化；M1~M5表现为甲基化，且去甲基化程度上升。其中，M1~M3表现为超低温保存后甲基化变化与D1~D3相反；M4~M5表现为在超低温保存后甲基化变化与D4~D5相反。

表3 超低温保存前后甲基化变异模式 Table 3 Models of methylation variations before and after cryopreservation

由表4可看出，四个马铃薯品种的变异带中，增加最多的均为M5型，减少最多的为D5型。根据Hao的分析方法(2002)进行统计，与对照比较，超低温技术保存过的4个样品共有89个新产生的甲基化位点，去甲基化的位点有147个，此外还有24个可能是新产生的也可能是去甲基化的位点。其中，完全去甲基化位点分别占3.2%、3.0%、2.6%和2.3%，不完全去甲基化位点分别占4.2%、3.9%、4.6%和3.0%；完全甲基化位点分别占0.7%、0.9%、1.1%和1.1%，半甲基化位点分别占3.6%、4.2%、3.1%和1.3%。超低温保存后，会发生甲基化增加和去甲基化，总体而言，去甲基化是超低温保存后的主要变化趋势。

表4 不同马铃薯品种超低温保存前后材料的带型变化 Table 4 Analysis of models of methylation variations in different potatoes before and after cryopreservation

2讨论
不同基因型的材料进行超低温保存后的效果不同。这种差异可能是由不同品种取材时的生长状况造成的，也可能是由材料本身的生理特性不同产生的。如王子成和邓秀新(2001)研究玻璃化法超低温保存四种抗寒性不同的柑桔茎尖，枳壳这一品种的抗寒性最强，其超低温保存后的再生率也最高，可达90%。李海兵等(2010)对4个不同基因型的怀山药进行包埋玻璃化法超低温保存时，再生植株的成活率差异显著。王子成和邓新秀(2002)的研究发现不同品种的胚性愈伤组织原生质体超低温保存后的成活率也是不同。本研究发现，不同基因型的马铃薯茎尖玻璃化超低温保存后的成活率和再生率均存在显著差异。4个材料均取自于试管苗基因库，避免了取材时生长状况不同而造成的差异。因此，差异可能是由材料本身的特性造成的。

通过对4个基因型马铃薯超低温保存前后的植株进行MSAP检测，发现马铃薯DNA甲基化模式比较丰富，3种模式均有出现(图1中的a, b, c)。当两个内切酶酶切DNA时产生的是小片段带，不对DNA酶切时，产生大片段带。因此，Ⅰ型带可能发生了DNA双链均没有甲基化，或单链DNA内部胞嘧啶甲基化；Ⅱ型带可能是双链DNA内部胞嘧啶发生了甲基化，即MspⅠ酶切的小片段可以经过PCR扩增出来，HpaⅡ不能酶切，其产生的大片段经PCR扩增后未被扩增出来，从而导致了H无带，M有带的模式；Ⅲ型带正好与前者情况相反，可能是单链DNA外部胞嘧啶甲基化或内外胞嘧啶都甲基化。结果表明，不同基因型的马铃薯扩增的带型相同，并且I型带多于Ⅱ和Ⅲ带型。与对照相比，材料经过超低温保存后会产生甲基化变异带，可见，马铃薯超低温保存前后产生的差异片段与甲基化模式密切相关。

环境因素是影响DNA甲基化变化的重要因素之一。潘雅姣等(2009)研究了水稻干旱情况下DNA甲基化的变化，发现水分胁迫导致DNA甲基化平均水平的明显增加。王连嵋等(2007)研究推断，空间环境对水稻蛋白组变化的影响是通过影响其DNA甲基化变化来实现的。何艳霞等(2007)研究了光暗条件下蒜的DNA甲基化模式变化，认为光照会引起大蒜DNA去甲基化，8对引物扩增出的不一致条带中，黑暗条件下与光照条件下相同的带型也是有差异的。Kovalchuk等(2003)证明去甲基化是一种简单的、间接应答逆境胁迫的方式，这种方式能够准确调控植物基因在逆境胁迫下的表达。本研究通过MSAP分析，四个基因型的马铃薯茎尖超低温保存后均发生了甲基化变化：甲基化增加和去甲基化现象都有产生，并且以去甲基化为主，这与曲先和王子成(2010)的研究结果一致。这种变化可能是材料为适应超低温保存过程中的各种胁迫而发生的自我修饰，也可能是由恢复培养时的暗环境造成的。DNA甲基化的一些位点主要存在于植物基因组内的转座子和反向转座子中。本试验中，超低温保存后材料的DNA甲基化发生变化，可能与马铃薯基因组中的某些转座子有关，从而使植株再生和分化时的相关基因得以表达，并且去甲基化与之关系尤为密切。

运用玻璃化法保存不同基因型的马铃薯，可获得其再生植株，并从表观遗传学上研究影响马铃薯种质资源DNA甲基化变异的条件和影响因素，说明MSAP技术是检测超低温保存前后植株DNA甲基化变异的有效方法。此外，本研究结果有利于提高马铃薯种质资源的保存质量，为长期稳定保存马铃薯种质资源，也为深入研究和广泛利用马铃薯种质资源中的优异基因资源奠定基础。

3材料与方法
3.1材料
试验材料为青薯9号、大西洋、E107、小白花4个基因型马铃薯的试管苗，均由青海省农林科学院生物技术研究所提供。

3.2玻璃化法超低温保存
参照王子成和邓秀新(2001)的方法进行玻璃化法超低温保存，稍作改进。保存程序为：选取继代培养30~40 d的健康植株，在无菌条件下，利用双目实体解剖镜剥取2~3 mm的茎尖，茎尖在预培养液中(MS+0.04 mg/L KT+0.1 mol/L蔗糖, pH 5.8, 过滤灭菌)培养6 h后，转至装载液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖，pH 5.8, 高温灭菌)中处理40 min，随之用0℃预冷的PVS2 (Plant vitrification solution 2)脱水处理35 min，最后装入冷冻管中，并置于液氮罐内保存24 h以上。将保存材料从液氮罐内取出，室温下解冻后转接到恢复培养基中，先后进行10 d暗培养和10 d弱光培养，之后转入正常光照下培养。半个月后统计成活率(转为绿色茎尖占每次试验材料总数的百分率)；1个月后统计再生率(长根, 叶原基展开即长芽的茎尖占每次试验材料总数的百分率)。

3.3 DNA的提取
参照邸宏等(2006)的CTAB方法，分别取4个品种的试管苗和超低温保存后的再生苗各10株，混合后提取DNA。DNA样品用ddH₂O稀释至50 ng/μL，储存于–20℃备用。

3.4 MSAP标记
MSAP分析参照Cervera等(2002)的方法并稍做优化。分别用EcoRⅠ/HpaⅡ、EcoRⅠ/MspⅠ组合对基因组DNA进行酶切，酶切体系：20 μL体系含DNA 250 ng，EcoRI和HpaⅡ/MspⅠ各5U，10×Buffer 2 μL，ddH₂O 11.5 μL，37℃下反应3.5 h。30 μL连接体系含E-adper 10 pmol，H/M-adper 10 pmol，T4 ligase 3 U，酶切产物20 μL，4℃下连接过夜。参照李芳弟(2010)所述方法对连接产物进行预扩增、选扩以及电泳等操作。表5为分子标记检测所用的接头及引物序列，均由上海生工公司合成。

表5 MSAP分析的接头和引物序列 Table 5 Sequence of adapters and primers used for MSAP analysis

3.5数据统计分析
试验结果由SAS 9.1版本和Excel软件统计分析，多重比较采用邓肯氏新复极差测验方法来进行。

作者贡献
石茹是本研究的试验设计和试验研究的执行人，并主要完成数据分析及论文写作；王芳参与试验设计、材料选择及试验结果分析；王舰是项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由现代农业产业技术体系专项资金(CARS-10)和青海省科技厅重点攻关项目(2008-N-164)共同资助。

参考文献
Cervera M.T., Ruiz-García L., and Martínez-Zapater J.M., 2002, Analysis of DNA methylation in Arabidopsis thaliana based on methylation-sensitive AFLP markers, Mol. Genet. Genomics., 268(4): 543-552

Di H., Chen Y.L., and Jin L.P., 2006, Genetic diversity analysis of Chinese main potato cultivars by RAPD and AFLP makers, Zuowu Xuebao (Acta Agronomica Sinica), 32(6): 899-904 (邸宏, 陈伊里, 金黎平, 2006, RAPD和AFLP标记分析中国马铃薯主要品种的遗传多样性, 作物学报, 32(6): 899-904)

Gonzalgo M.L, and Jones P.A., 1997, Mutagenic and epigenetic effects of DNA methylation, Mutat. Res., 386(2): 107-118

Hong L., and Deng X.X., 2005, Analysis of DNA Methylation in Navel Oranges Based on MSAP Marker, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 38(11): 2301-2307 (洪柳, 邓秀新, 2005, 应用MSAP技术对脐橙品种进行DNA甲基化分析, 中国农业科学, 38(11): 2301-2307)

Hao Y.J., You C.X., and Deng X.X., 2002, Analysis of ploidy and the patterns of amplified fragment length polymorphism and methylation sensitive amplified polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation, Cryo. Letters, 23(1): 37-46

He Y.X., Wang Z.C., Cao H.P., and Zhang C.W., 2007, Initial study of DNA methylation difference of garlic (Allium sativum L.) growing in light and darkness, Zhiwu Shenglixue Tongxun (The plants in the journal of physiology newsletter), 43(1): 115-118 (何艳霞, 王子成, 曹红平, 张成婉, 2007, 光暗条件下大蒜DNA甲基化差异的初步研究, 植物生理学通讯, 43(1): 85-88)

He Y.X., and Wang Z.C., 2009, Variation of DNA methylation in Arabidopsis thaliana seedlings after the cryopreservation, Zhiwu Xuebao (Chinese Bulletin of Botany), 44(3): 317-322 (何艳霞, 王子成, 2009, 拟南芥幼苗超低温保存后DNA甲基化的遗传变异, 植物学报, 44(3): 317-322)

Kaity A., Ashmore S.E., Drew R.A., and Dulloo M.E., 2008, Assessment of genetic and epigenetic changes following cryopreservation in papaya, Plant Cell Rep., 27(9): 1529-1539
Kovalchuk O., Burke P., Arkhipov A., Kuchma N., James S.J., Kovalchuk L., and Poqribny L., 2003, Genome hypermethylation in Pinus silvestris of Chernobyl-a mechanism for radiation adaptation?, Mutat. Res., 529(1-2): 13-20

Labra M., Chiani A., Citlerio S., Sgorbati S., Sala F., Vannini C., Ruffini-Castiglione M., and Bracale M., 2002, Analysis of cytosine methylation pattern in response to water deficit in pea root tips, Plant Biology, 4(6): 694-699

Li F.D., 2010, AFLP assessment of genetic diversity of potato germplasm resouces, Thesis for M.S., Qinghai University, Supervisor: Wang J., pp.26-31 (李芳弟, 2010, 马铃薯种质资源遗传多样性的AFLP分析, 硕士学位论文, 青海大学, 导师: 王舰, pp.26-31)

Li H.B., Zhou N., Zhao J., Li X., Feng Q.Y., Zhao X.T., and Li M.J., 2010, Cryopreservation and plantlet regeneration of germplasm resources of Dioscorea opposita by encapsulation-vitrification, Zhiwu Xuebao (Chinese Bulletin of Botany), 45(3): 379-383 (李海兵, 周娜, 赵娇, 李翔, 冯秋妍, 赵喜亭, 李明军, 2010, 怀山药种质资源的包埋玻璃化超低温保存与植株再生, 植物学报, 45(3): 379-383)

Mao X.G., Li A., and Jing R.L., 2010, Plant DNA mehtylation and crop germplasm conservation, Zhiwu Yichuan Ziyuan Xuebao (Journal of Plant Genetic Resources), 11(6): 659-665 (毛新国, 李昂, 景蕊莲, 2010, 植物DNA甲基化与作物种质资源保存, 植物遗传资源学报, 11(6): 659-665)

Meyer P., Niedenhof I., and ten Lohuis M., 1994, Evidence for cytosine methylation of non-symmetrical sequence in transgenic Petunia hybrida, EMBO J., 13(9): 2084-2088

Pan Y.H., Fu B.Y., Wang D., Zhu L.H., and Li Z.K., 2009, Spatial and temporal profiling of DNA methylation induced by drought stress in rice, Zhongguo Nongye Kexue (Scientia Agricultura Sinica), 42(9): 3009-3018 (潘雅姣, 傅彬英, 王迪, 朱苓华, 黎志康, 2009, 水稻干旱胁迫诱导DNA甲基化时空变化特征分析, 中国农业科学, 42(9): 3009-3018)

Qu X., and Wang Z.C., 2010, Cryopreservation of potato (Solanum tuberosum L.) shoot-tips and preliminary observations of its genetic variation, Zhiwu Shenglixue Tongxun (Plant Physiology Communications), 46(1): 11-16 (曲先, 王子成, 2010, 马铃薯(Solanum tuberosum L.)茎尖的超低温保存及其遗传变异的初步观察, 植物生理学通讯, 46(1): 11-16)

Rossi V., Motto M., and Pellegrini L., 1997, Analysis of the methylation pattern of the maize Opaque-2 (O2) promoter and in vitro binding studies indicate that the O2 B-Zip protein and other endosperm factors can bind to methylated target sequences, J. Biol. Chem., 272(21): 13758-13765

Tan M., 2010, Analysisi of DNA methylation of maize in response to osmotic and salt stress based on methylation-sensitive amplified polymorphism, Plant Physiol. Biochem., 48(1): 21-26

Ulian E.C., Magill J.M., Magill C.W., and Smith R.H., 1996, DNAmethylation and expression of NPTII in transgenic petunias and progeny, Theor. Appl. Genet., 92(8): 976-981

Wang Q., Liu Y., Xie Y., and You M., 2006, Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of potato leafroll virus (PLRV) and potato virus Y (PVY), Potato Research, 49(2): 119-129

Wang L.M., 2007, Proteomic and dna methylation changes in an elite rice induced by space environment, Thesis for M.S., Harbin Institute of Technology, Supervisor: Sun Y.Q., pp.34-38 (王连嵋, 2007, 空间环境引起水稻DNA甲基化与蛋白质组变化及其关联分析, 硕士学位论文, 哈尔滨工业大学, 导师: 孙野青, pp.34-38)

Wang Z.C., and Deng X.X., 2001, Cryopreservation of citrus shoot-tips by vitrification and regeneration, Yuanyi Xuebao (Acta Horticulturae Sinica), 28(1): 301-306 (王子成, 邓秀新, 2001, 玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再生, 园艺学报, 28(1): 301-306)

Wang Z.C., and Deng X.X., 2002, Cryopreservation of citrus protoplasts, He’nan Daxue Xuebao (Journal of Henan University (Natural Science)), 32(3): 38-40 (王子成, 邓秀新, 2002, 柑橘原生质体的超低温保存, 河南大学学报(自然科学版), 32(3): 38-40)