植物在生长过程中会遭受各种非生物胁迫，低温、盐碱、干旱是限制植物生长和作物产量的主要环境因素(Shinozaki et al., 2003)。胁迫相关的基因在转录水平上的表达调控对于植物应对环境胁迫至关重要，诱导基因表达升高和下降(Xiong et al., 2002)。转录因子在植物对外界环境胁迫和植物生长发育方面起重要调节作用(王景晨和陈信波, 2011)。能够与真核基因启动子区域的顺式作用元件发生特异相互作用抑制或激活基因转录(刘守海等, 2012)。锌指蛋白是一类重要的转录因子，自Miller等(1985)在非洲爪蟾转录因子TFⅢA中发现了第一个锌指结构以来，人们发现了大量具有锌指结构的蛋白质，统称为锌指蛋白。根据锌指结构域保守的氨基酸残基Cys和His的组合，人们把锌指蛋白分为C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC和C3H型等不同类型(Miller et al., 1985; 赵楠等, 2009)。

植物中C2H2型锌指蛋白的研究较早，如在水稻的ZFP179基因和胡杨的PSTZ基因，显著增强了对盐胁迫的耐受性；过表达ZFP245的转基因水稻具有抗低温和干旱的特点(Sun et al., 2010; Wang et al., 2008; Huang et al., 2009)；到目前为止在植物WRKY转录因子C端发现C2HC锌指结构域(郝中娜和陶荣祥, 2009)。在低等生物中发现了C2HC型锌指蛋白如克氏锥虫的PZFP1，以及在果蝇Nanos蛋白中发现了C2HC型锌指结构域(Curtis et al., 1997; Espinosa et al., 2003)。C2HC型锌指蛋白既能结合单链DNA也能结合RNA，广泛地参与细胞生长过程的转录调控，3’顺式剪接位点选择，多顺反子RNA切割，多聚腺苷酸化和同源重组(Frank et al., 1992; Taylor et al., 1993; Hendriks et al., 2003)。

水稻是世界上重要的粮食作物之一，同时也是分子生物学研究的模式植物(Cantrell and Reeves, 2002)。但目前对水稻C2HC型锌指蛋白基因功能研究尚未见报道。本研究用RT-PCR技术从水稻中克隆已知基因(AK103785)，命名为OsC2HC-1，利用分子生物学数据库分析，并与其他植物进行比对，确定保守的C2HC锌指结构域。应用酵母菌INVsI表达OsC2HC-1与绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白初步定位，洋葱表皮亚细胞定位验证定位结果。采用实时荧光定量PCR技术检测OsC2HC-1的mRNA表达特性。将OsC2HC-1构建到原核表达载体上，表达纯化了OsC2HC-1蛋白；构建植物过表达载体转化拟南芥，萌发后期幼苗抗性分析实验进一步确定与逆境胁迫相关性。为进一步研究OsC2HC-1与水稻抗逆相关基因的相互作用及调控机制奠定基础。

1结果与分析
1.1 OsC2HC-1基因的克隆及序列分析
按照TRIzol试剂说明书上的步骤，提取日本晴根与叶组织的总RNA并进行电泳检测(图1)。结果显示28S，18S RNA条带清晰可见，且28S RNA的含量大约是18S RNA含量的两倍。说明提取的总RNA未发生降解，可以反转录成cDNA。利用设计的特异引物进行PCR扩增得到一条1 600 bp左右大小的cDNA条带(图2)，插入pMD18-T酶切(图3)，与预期大小相符。测序结果显示与GenBank登陆的序列完全一致，其基因编码区全长1 019 bp，编码339个氨基酸。在NCBI氨基酸同源性比对显示OsC2HC-1与拟南芥，玉米，葡萄等中的锌指蛋白都具有保守的C2HC锌指结构域(图4)。

图1 水稻总RNA提取电泳图 Figure 1 Electrophoresis of total RNA of rice

图2 水稻OsC2HC-1基因cDNA的PCR扩增结果 Figure 2 cDNA of OsC2HC-1 gene in amplified by PCR

图3 pMD18-T- OsC2HC-1的双酶切鉴定 Figure 3 pMD18-T- OsC2HC-1 digested by double enzymes

图4 OsC2HC-1基因锌指结构域序列保守性分析 Figure 4 Sequence conservative analysis of OsC2HC-1 zinc finger domain

2.2转化酵母和洋葱表皮细胞的OsC2HC-1基因亚细胞定位
    为了明析OsC2HC-1的亚细胞位置，本研究采用聚乙二醇/醋酸锂(PEG/LiAc)诱导的化学转化法将pYES2::GFP, pYES2::OsC2HC-1::GFP转入酿酒酵母菌INVScI中，经半乳糖诱导表达后用激光共聚焦显微镜检测荧光，结果观察到pYES2::GFP对照在酵母细胞质中大量表达(图5A-图5C)，而OsC2HC-1::GFP的融合蛋白只在酵母细胞核中表达(图5D-图5F)。然而酵母是单细胞真核生物，本研究为进一步定位验证，运用基因枪法将pBS-GFP, pBS::OsC2HC-1::GFP DNA转入洋葱表皮细胞黑暗培养18 h后撕取表皮进行压片，利用激光共聚焦显微镜观察GFP荧光，结果显示pBS::GFP对照在洋葱表皮的细胞膜和细胞质中表达(图6A-图6C)，而OsC2HC-1::GFP的融合蛋白在洋葱表皮的细胞核中大量表达，部分细胞膜上也能观察到GFP荧光(图6E-图6F)，这可能是OsC2HC-1基因与相互作用基因结合在细胞膜上行使功能，有待深入研究。结合酵母细胞定位和洋葱表皮细胞定位结果，OsC2HC-1定位于细胞核与网络生物信息软件预测的结果相一致(http://wolfpsort.org/)。

图5 OsC2HC-1在酵母细胞中的定位 Figure 5 OsC2HC-1 located in yeast cells

图6 OsC2HC-1在洋葱表皮细胞中的定位 Figure 6 OsC2HC-1 located in onion epidermal cells

2.3逆境胁迫下OsC2HC-1的mRNA表达特性分析
为了研究水稻OsC2HC-1基因对非生物胁迫的应答相关性，采用实时荧光定量PCR技术分析其mRNA在盐碱及氧化胁迫下的表达特性。结果表明OsC2HC-1显著地受盐(NaCl)碱(NaHCO₃)胁迫诱导表达，在H₂O₂胁迫下表达量提高，但不如盐碱胁迫诱导明显。实时定量PCR结果表明，随着盐(NaCl)碱(NaHCO₃)，H₂O₂胁迫时间的延长，OsC2HC-1的转录水平都有增加的趋势。NaCl胁迫下(图7A; 图7B)，OsC2HC-1在叶和根中的表达量依次增加，在24 h时表达量达到最大，48 h表达量有所下降；NaHCO₃胁迫下(图7C; 图7D)，OsC2HC-1在叶中表达量逐渐增加，48 h表达量最高，约是未处理条件下表达量的7.5倍，根在处理12 h时表达量略微下降，24 h表达量急剧上升达到最大值，而后迅速下降，几乎与未处理时表达水平一致；H₂O₂胁迫下(图7E; 图7F)，OsC2HC-1在叶中表达量12 h为最大值，约为对照的2倍，之后缓慢下降，在根中表达量12 h明显多于对照。实验结果显示出OsC2HC-1受盐碱逆境胁迫的诱导而转录表达上调，尤其是在NaCl、NaHCO₃胁迫下表达量显著提高，叶中最大表达量分别比正常条件下提高约5.5倍和7.5倍，根中最大表达量分别比正常条件下提高约3.75倍和3.5倍，说明OsC2HC-1是与盐碱逆境胁迫的相关基因，由H₂O₂胁迫诱导表达增加推测 OsC2HC-1可能通过转录调节氧化相关的基因来应答逆境胁迫从而提高抗性。

图7 盐(NaCl)碱(NaHCO3)及氧化(H2O2)胁迫下OsC2HC-1基因的实时定量表达分析 Figure 7 Real-time quantitative expression analysis of OsC2HC-1 gene under stresses of salt (NaCl), alkali (NaHCO3), and oxidative (H2O2)

2.4融合蛋白的小量诱导表达及条件的优化
将pGEX-6p-3和重组载体pGEX-6p-3::OsC2HC-1分别转化BL21菌株，经1 mmol/L IPTG在28℃下诱导，时间梯度为0、1 h、2 h、3 h、4 h和5 h。分别集菌处理后12%的分离胶行SDS-PAGE电泳(图8)，结果表明，诱导后重组质粒能够表达出约63 kD的特异融合蛋白，且随着诱导时间的增加蛋白的表达量增加，在4 h时达到最大值；空载体能够诱导出26 kD的条带，符合GST标签大小，由此得出OsC2HC-1蛋白分子量大小约为37 kD，与预测结果一致。融合蛋白的小量诱导表达及表达条件的优化实验表明：GST-OsC2HC-1融合蛋白的分子量大小为63 kD，最佳诱导时间为4 h。

图8 SDS-PAGE分析诱导时间对GST-OsC2HC-1融合蛋白表达的影响 Figure 8 The influence of the IPTG induction time on expression of the GST-OsC2HC-1 fusion proteinindentified by SDS-PAGE

2.5融合蛋白的大量诱导及纯化
为制作抗体和该蛋白的免疫共沉淀研究大量诱导纯化融合蛋白，根据已优化的诱导条件，在200 mL LB培养基中培养转入重组质粒的BL21菌液至OD₆₀₀值为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，于28℃诱导4 h后对菌体进行超声破碎，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳结果显示，裂解后的上清中不存在融合蛋白，融合蛋白全部以包涵体存在于沉淀中。将包涵体用8 mol/L尿素溶解后，采用Sepharose 4B亲和吸附的方法对融合蛋白纯化，SDS-PAGE电泳分析显示纯化的融合蛋白呈单一条带(图9)，纯化GST-OsC2HC-1融合蛋白大小与小量诱导表达的一致，我们就得到了包涵体的纯化融合蛋白，但是，它也为抗体的制作及进一步的深入研究准备了条件。

图9 大量诱导及纯化GST-OsC2HC-1融合蛋白的SDS-PAGE分析 Figure 9 SDS-PAGE analysis of large amount of induced and purified GST-OsC2HC-1 fusion protein

2.6转OsC2HC-1::GFP基因拟南芥的分子检测
为了检测转化的Kana 抗性T1代拟南芥(T3-2#, 3#, 4#, 5#)株系整合OsC2HC-1::GFP基因情况。CTAB法提取叶片基因组DNA，稀释50倍作为PCR模板，以特异引物(P11, P12) PCR检测结果显示(图10)，扩增出与OsC2HC-1::GFP(CK⁺)质粒DNA的PCR产物大小一致的片段(约1 850 bp)，而野生型拟南芥作为阴性对照(CK^-) 则没有出现该条带，表明OsC2HC-1::GFP基因已成功整合到以上植株基因组的染色体上。

图10 转OsC2HC-1::GFP基因拟南芥T1代株系PCR的检测 Figure 10 T1 generation of OsC2HC-1::GFP transgenic Arabidopsis detected by PCR

2.7过表达OsC2HC-1::GFP基因拟南芥萌发后期的抗逆性分析
转OsC2HC-1::GFP基因的T3代拟南芥株系(T3-2#, -3#, -5#)和拟南芥WT种子经消毒除菌后置于1/2MS培养基上发芽7 d，选取生长一致的两叶幼苗进行抗逆性分析，幼苗分别移接到NaCl，NaHCO₃和H₂O₂培养基上，经14 d胁迫生长。无逆境胁迫时，WT和转OsC2HC-1::GFP基因拟南芥株系生长状况良好(图11A)；NaCl胁迫处理下从叶片可以看出生长均受抑制的表型(图11B-图11D)，随着NaCl胁迫浓度增加植株根的生长量明显受抑制，125 mmol/L NaCl胁迫下转基因株系叶的生长明显优于WT；1 mmol/L NaHCO₃胁迫下(图11E)，生长未受到明显抑制，3 mmol/L NaHCO₃胁迫下(图11F)，叶受到严重伤害，但转基因2#株系的叶生长表型显著优于WT。H₂O₂胁迫处理下(图11G-图11I)，对叶的生长影响不大，但根生长表型严重受到抑制，转基因株系与WT生长相比没出现差别。对以上逆境胁迫下根生长量检测显示(图11J)，125 mmol/L NaCl、1 mmol/L NaHCO₃和1 mmol/L H₂O₂胁迫下转基因株系根的生长量明显著优于WT；在NaCl，NaHCO₃和H₂O₂胁迫下(图11K)，检测到转基因株系的鲜重显著大于WT。萌发后期的抗性分析实验表明，过表达OsC2HC-1::GFP基因拟南芥转化株系比WT拟南芥显示出一定的抗盐碱性，推测OsC2HC-1基因可能通过其锌指结构域结合耐盐碱相关基因启动子的特征区域，调控相关基因表达上调，减轻盐碱毒害。

图11 过表达OsC2HC-1::GFP基因拟南芥萌发后期的抗逆性分析 Figure 11 Resistant analysis of transgenic Arabidopsis over-expressing OsC2HC-1::GFP after germination

2讨论
在研究抗逆性相关基因过程中，人们发现具有提高抗逆性作用的转录因子，一些转录因子能调控许多抗逆功能基因同时表达(Liu et al., 1998; Gilmour et al., 2000)，锌指桔构域是识别基因启动子区特定碱基序列的一种普遍性的转录因子结构，通过基因工程技术过量表达一些锌指蛋白可以提高植物的抗(耐)非生物胁迫的能力(田路明等, 2005)。

研究者已从水稻中发现多种参与非生物胁迫反应的锌指蛋白基因，多为C2H2型，例如从一种印度籼稻中克隆得到了一个C2H2型锌指蛋白基因OSISAP1，显著地被ABA，高盐，低温，干旱诱导表达，过表达OSISAP1的转基因烟草在种子萌发和苗期相对于野生型提高了对盐，干旱，寒冷的抗性(Mukhopadhyay et al., 2004)。因此为了尝试研究C₂HC型转录因子改良植物的抗逆性，本研究从水稻中运用RT-PCR技术克隆得到已知基因(GenBank: AK103785)，命名为OsC2HC-1，利用分子生物学数据库和分析软件对该基因蛋白质序列进行分析，并与其他植物进行比对(图4)，确定其具有保守的C2HC锌指结构域，属于C₂HC锌指蛋白。应用酵母菌INVScI表达OsC2HC-1与绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白初步确定其定位于细胞核(图5; 图6)，再利用洋葱表皮细胞得出与TFⅢA型锌指蛋白ZFP182同样定位于细胞核，过表达ZFP182的水稻中游离脯氨酸和可溶性糖含量升高，对盐、干旱和寒冷胁迫抗性增强(Huang et al., 2012)。而我们采用实时荧光定量PCR技术检测OsC2HC-1基因在盐(NaCl)碱(NaHCO₃)及氧化(H₂O₂)胁迫下的mRNA表达特性(图7)，发现OsC2HC-1基因受盐碱逆境诱导表达而上调，预示了OsC2HC-1基因与水稻抗盐碱胁迫相关。

为了明晰过表达OsC2HC-1基因能够提高植物的抗性，我们将构建的植物表达载体pBI121::OsC2HC-1::GFP，转入拟南芥，对抗性转化株系进行萌发后期的抗性分析(图11)，结果表明在125 mmol/L NaCl，1 mmol/L NaHCO₃，3 mmol/L NaHCO₃胁迫下，过表达OsC2HC-1::GFP的转基因拟南芥表现出比野生型较强的抗性，这一结果互应了实时定量OsC2HC-1基因应激表达上调，说明OsC2HC-1基因在抗盐碱中起作用，有抗氧化性鲜后果表型的相关性，OsC2HC-1基因可能是通过调控氧化胁迫通路提高抗性的。具体的其作用机理还有待进一步研究，推测OsC2HC-1可能转录激活抗逆性功能基因的表达来提高对逆境胁迫的抗性。已有研究报道称通过微阵列分析得到的一个C2H2型锌指蛋白ZFP179，过量表达ZFP179水稻中的可溶性糖与游离脯氨酸的含量增加，活性氧清除能力提高，在盐胁迫下一些胁迫相关基因的表达水平提高，如OsDREB2A、OsP5CS、OsProT和OsLea3。因此表现较强的抗盐性和抗氧化性(Sun et al., 2010)。目前对于水稻锌指蛋白调控靶基因的作用机理还不清楚，本研究将OsC2HC-1构建到原核表达载体上，摸索融合蛋白诱导表达条件后大量诱导并成功地纯化了GST::OsC2HC-1融合蛋白，可以制作OsC2HC-1的抗体，再运用染色质免疫沉淀技术探究OsC2HC-1调控的靶基因，为进一步研究OsC2HC-1与水稻抗逆相关基因的相互作用及调控机制奠定了基础。

3材料与方法
3.1材料
3.1.1植物材料
水稻(日本晴)水培法培养至三叶期(两周)，剪取叶和根液氮冷冻保存置于-80℃冰箱用于RNA提取。

3.1.2菌株和载体
pYES2-MCS-GFP，pBS-MCS-GFP，pBI121-MCS-GFP质粒DNA，pGEX-6p-3载体(GE Healthcare)酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae) INVScI (Invitrogen)，大肠杆菌(Escherichia coli) JM109，BL21(DE3)和农杆菌(EHA105)感受态细胞为本实验室制作并保存。

3.1.3主要试剂
高保真EX-Taq DNA Polymerase，pMD18-T Vector，反转录试剂盒均购自TakaRa公司，T4 DNA Ligase，限制性内切酶，胶回收试剂盒购自MBI (Fermentas)公司，TRIzol Reagent购自Invitrogen公司，质粒提取试剂盒购自TIANGEN公司，Glutathione Sepharose 4 Fast Flow纯化柱购自GE Healthcare公司。实时定量荧光染料SYBR Green QPCR Master Mix购自Agilent公司。

3.2方法
3.2.1水稻总RNA的提取及反转录
采用TRIzol一步法分别提取日本晴根和叶的总RNA，各取1μg 总RNA为模板分别用反转录试剂盒(TOYOBO)反转录成cDNA，各取1 μL cDNA混合后稀释10倍作为克隆PCR模板。

3.2.2 OsC2HC-1基因的克隆及序列分析
利用primer premier 5.0软件设计OsC2HC-1基因(AK103785)特异引物克隆，上游引物P1：5’-AGCCTCCATCCTTTGCTGTC-3’，下游引物P2：5’- TAACCCAAGGCTG TGGAACT-3’。采用Takara EX-Taq高保真酶进行扩增。PCR反应条件如下95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 2 min，35个循环，72℃延伸10 min结束。PCR扩增产物经胶回收后连接到pMD18-T Vector (Takara)上，酶切鉴定后测序。其他植物的C2HC型锌指蛋白序列来自National Center for Biotechnology information (NCBI)数据库BLAST进行OsC2HC-1的特征区域氨基酸序列多重比对。

3.2.3通过转化酵母细胞和洋葱表皮细胞基因定位
3.2.3.1表达载体pYES2-OsC2HC-1::GFP的构建及酵母转化
用KpnⅠ和SacⅠ分别双酶切pBS-OsC2HC-1::GFP质粒DNA和pYES2载体DNA，T4 DNA Ligase连接，构建pYES2-OsC2HC-1::GFP重组载体。采用聚乙二醇/醋酸锂(PEG/LiAc)诱导的化学转化法转化酵母菌株INVScI (Invitrogen)，半乳糖诱导重组质粒表达，激光共聚焦显微镜(Olympus)扫描观察绿色荧光表达定位。

3.2.3.2瞬时表达载体pBS-OsC2HC-1::GFP的构建及基因枪转化
以测序的质粒DNA为模板，用增加KpnⅠ和SpeⅠ位点的特异引物(P3: 5’-GGTACCATGGCATCAGATCCACTT-3’; P4: 5’-ACTAGTTGGCGATGGCCAGTACC-3’)扩增ORF序列，连接到pMD18-T Vector上，用KpnⅠ和SpeⅠ分别双酶切pBS-MCS-GFP和pMD18-T::OsC2HC-1 DNA，1%凝胶电泳后胶回收载体和目的片段，用T4 DNA Ligase (Fermentas)连接载体和目的基因片段，构建pBS-OsC2HC-1::GFP重组载体，KpnⅠ和SpeⅠ双酶切鉴定重组质粒DNA。稀释鉴定正确的pBS-OsC2HC-1::GFP的浓度至终浓度1 μg/μL，-20℃保存备用。参照Barandiaran等(1998)的方法进行DNA-金粉(Bio-Rad 1.0 μm)微弹的制备，用基因枪(Bio-Rad)将制好的DNA-金粉微弹轰击洋葱内表皮，将洋葱放在盛有润湿的灭菌滤纸的培养皿中，暗培养24 h后，通过激光共聚焦显微镜(Olympus)观察OsC2HC-1::GFP融合蛋白绿色荧光表达。

3.2.4原核表达载体pGEX-6p-3::OsC2HC-1的构建及其融合蛋白表达纯化
3.2.4.1载体构建及表达宿主菌转化
以pMD18-T::OsC2HC-1为模板，用增设BamHⅠ和SalⅠ位点OsC2HC-1特异引物(P5: 5’-GGATCCATGGCATCAGATCCACTTG-3’; P6: 5’-GTCGACTGGCGATGGCCAGTAC-3’)，PCR扩增ORF，连接到pMD18-T Vector上，用BamHⅠ和SalⅠ分别双酶切pGEX-6p-3载体和T::OsC2HC-1 DNA，胶回收载体和目的片段DNA，连接，构建pGEX-6p-3::OsC2HC-1原核表达载体，转化感受态E. coli JM109，双酶切鉴定正确后，热激转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，同时转化空质粒pGEX-6p-3到BL21(DE3)为对照，接种于含Amp (100 μg/mL)的LB平板上培养过夜，挑取单克隆37℃振摇培养过夜。

3.2.4.2融合蛋白的小量诱导表达及表达条件的优化
取过夜培养的重组表达菌200 μL，加入到含Amp (100 μg/mL)的1.8 mL LB溶液中37℃振摇培养至培养液OD₆₀₀达0.4~0.6，加入0.5 mol/L IPTG 4 μL，使其终浓度为1 mmol/L，设置时间梯度1 h、2 h、3 h、4 h和5h，置于28℃摇床振荡培养后，收集菌体，12% SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达，确定最佳表达时间。

3.2.4.3融合蛋白的大量诱导及纯化
根据实验得到的最佳诱导时间4 h和IPTG浓度0.5 mmol/L，在28℃条件下大量诱导表达融合蛋白，培养体积为200 mL，收集菌体后，重悬于20 mL 1×PBS (pH7.4)中，加入200 mg溶菌酶，振荡冰浴30 min，超声破碎10 min后，4℃离心分别收集上清与沉淀进行SDS-PAGE分析，检测融合蛋白表达。将沉淀(包涵体)溶于20 mL 8 mol/L尿素中，4℃离心收集上清，通过Glutathione Sepharose 4 Fast Flow纯化柱收集纯化的融合蛋白，行10% SDS-PAGE电泳，检测分析。

3.2.5逆境胁迫下OsC2HC-1基因的 mRNA表达特性分析
水培法培养至三叶期，分别用80 mmol/L NaCl，30 mmol/L NaHCO₃和10 mmol/L H₂O₂处理，处理时间为12 h、24 h和48 h，以加入清水为对照处理(即0处理)，分别收取根和叶，液氮速冻研磨后，用TRIzol一步法提取总RNA，以1 μg总RNA为模板用反转录试剂盒反转录成cDNA，稀释10倍作为定量PCR模板。荧光染料(SYBR Green) RQ-RT-PCR法测定OsC2HC-1基因的表达量变化。设计特异引物(P7: 5’-GCCATCGCCATAGTAGTTCTCCT-3’; P8: 5’-CATAACCCAAGGCTGTGGAACT-3’)，PCR反应条件为95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。用2×Brilliant Ⅲ SYBR Green QPCR Master Mix (Agilent)进行PCR反应，反应体系设为20 μL。PCR反应的数据采集在MxPro-Mx3000P系统上进行。以Actin1基因(P9: 5’-CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA-3’; P10: 5’-CGACC ACCTTGATCTTCATGCTGCTA-3’)为内参对所有样品进行归一化处理，同时设置无模板对照(NTC)，每个反应重复两次。反应结束后由系统计算出基因的相对表达量，根据表达量变化绘制柱形图。

3.2.6 OsC2HC-1对拟南芥遗传转化及转基因拟南芥的分子检测
构建植物表达载体pBI121-OsC2HC-1::GFP时，根据水稻OsC2HC-1基因cDNA序列，在ORF的前5’端增BamHⅠ和3’端增SacⅠ位点设计合成引物(P11: 5’-GGATCCATGGCATCAGATCCACTTG-3’; P12: 5’-GAGCTCCTATGGCGATGGCCAGT-3’)。以测序的pMD18-T::OsC2HC-1 DNA为模板，PCR扩增OsC2HC-1基因阅读框DNA片段。经pMD18-T载体过渡，用BamHⅠ和SacⅠ酶切连接构pBI121-MCS-GFP载体上，得pBI121::OsC2HC-1::GFP植物表达载体。用电转化法导入农杆菌EHA105中。用农杆菌介导法对拟南芥遗传转化(Gong et al., 1996)，收获的种子在含50 mg/L Kana的1/2MS培养基上筛选，得到的抗性植株用于分子鉴定。

用CTAB法提取转基因(T1代)和非转基因(WT)拟南芥植株叶片基因组DNA，稀释50倍作为PCR模板，进行PCR扩增。引物为在pBI121载体上设计的通用引物，反应体积为50 μL，反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸l min，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物进行琼脂糖电泳分析。收取阳性T1代苗的种子，筛选到T3代用于萌发后期的抗性分析实验。

3.2.7过表达OsC2HC-1::GFP基因拟南芥萌发后期的抗性分析
对CaMV35S启动下过量表达的T3代转OsC2HC-1::GFP株系做抗盐(NaCl)碱(NaHCO₃)及氧化(H₂O₂)胁迫分析。取T3代株系(T3-2#; -3#; -5#)和WT种子消毒灭菌，播种在1/2MS培养基上发芽7 d，然后将与WT生长一致的两叶苗移接到1/2MS+100 mmol/L，125 mmol/L和150 mmol/L NaCl，1/2MS+1 mmol/L，3 mmol/L NaHCO3，1/2MS+0.5 mmol/L，1 mmol/L和1.5 mmol/L H₂O₂培养基上做萌发后胁迫生长试验，以1/2MS培养基作为对照，设置三次重复，14 d后调查生长情况。观察表型变化，检测盐碱及氧化胁迫对各株系的根长生长的影响，以及鲜重的差异。

作者贡献
管清杰是本研究的实验设计和实验研究的执行人，参与实验设计，试验结果分析，是项目的构思者及负责人；郑恒完成数据分析，论文初稿的写作；柳参奎指导实验设计，数据分析和论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由中央高校基本科研业务费专项资金(DL11CA05)、国家林业局“948”项目(2008429)和中国博士后基金(2012M520695)共同资助。

参考文献
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