将外源基因导入受体植物内，是研究基因功能的主要手段之一。Rossi等(1993)首先建立了农杆菌介导的基因瞬时表达系统，之后人们又通过改进建立了针管注射活体植株叶片的基因瞬时表达检测方法(Twyan et al., 2003; 邱礽等, 2009)。该方法利用真空渗透或针管注射使根癌农杆菌与植物细胞充分接触，在转录水平上诱导根癌农杆菌激活Ti质粒上的Vir区基因，使T-DNA转移到植物细胞核中。少量与植物染色体整合的T-DNA，在瞬时表达中作用微弱(Kapila et al., 1997; 刘兆明等, 2002)。

Orzaez等(2006)的研究表明，从番茄花柱顶端注射农杆菌渗入整个果实后，在果实中可检测到瞬时表达的目的基因。Hoffmann等(2006)在草莓(Fragaria×ananassa cv. Eisanta)果实注射查尔酮合成酶(CHS)基因片段的反向重复序列，也检测到CHS的mRNA和它的酶活都有所降低。因此在转化植物之前若要快速获得转基因的表达情况，可通过农杆菌介导的基因瞬时表达方法对构建的表达载体做初步快速的评估(Fischer et al.,1999)，从而节约了时间和资源，减少试验的盲目性。

番茄是世界上广泛栽培的蔬菜作物之一，其产量和品质高低直接影响了人们的消费水平。糖分积累是果实品质形成的关键因素之一，而蔗糖代谢又是糖分积累的重要环节。蔗糖转化酶是蔗糖代谢的关键酶之一，它参与蔗糖的分解代谢(Sturm, 1999)。研究对于转化酶活性的调节可以通过两种途径实现，一是以反义方式抑制转化酶的表达，转化植株的转化酶活性虽明显升高，但蔗糖积累增加的果实减小了近30%；二是通过增强表达与转化酶特异性结合的抑制子来减少蔗糖的降解。这种内源转化酶抑制子(INH)的调节是植物酸性转化酶翻译后调节的一个重要方面，备受人们的关注。Greiner等(1998)首次从烟草中克隆出NtCIF和NtVIF的cDNA，至今已在多种植物中发现。近几年来对INH已有了一些相关的研究(姜晶等, 2009; Jin et al., 2009)，证明了INH可以在体外抑制Inv的活性(Greiner et al., 1998; Bate et al., 2004; Bonfig et al., 2010)。但当前缺乏验证INH在活体内对Inv活性抑制作用的相关实验证据。

本研究主要通过根癌农杆菌介导的瞬时表达方法，在转化番茄之前快速地检测INH基因在果实中的表达情况和相应的转化酶酶活变化，为最终获得转基因番茄、提高蔗糖含量奠定实验基础。

1结果与分析
1.1源叶注射农杆菌蔗糖转化酶基因家族及抑制子相对表达含量的差异
Micro-Tom的源叶在注射农杆菌EHA105后，Lin6基因主要在叶片表达(图1)。当用农杆菌菌液进行源叶注射后，Lin6的表达量增加最明显，为未注菌(空白对照)的2~5倍。作为一种应激反应，这表明细胞壁转化酶增加在植株中具有响应病菌侵染的作用。同时，基因的表达可持续到注菌后5~7 d左右，说明根癌农杆菌介导的瞬时表达系统可以在番茄中建立(图1)；番茄源叶注射果实特异性表达载体，在图1D中可看到有少量INH的表达。其可能原因是由于瞬时表达中存在部分未整合到核基因组的含INH的片段，所以相比较而言，应在果实特异表达的INH基因在源叶注射部位也有少量“表达”。

图1 Micro-Tom番茄源叶农杆菌注射处理后蔗糖转化酶基因家族及抑制子的相对表达含量 Figure 1 Activity of sucrose invertase in Micro-Tom tomato fruits after Agroinfiltration treatment

1.2果实注射农杆菌后蔗糖转化酶基因家族及抑制子相对表达含量的差异
图2和图3分别是Lin5、Lin6基因在果实注射后3 d和5 d的表达情况。在果实不同部位，Lin5相对表达量在胶质胎座最高，中果肉和心室隔壁次之。在瞬时表达的系统中，Lin5表达量与对照(图2A)相比没有明显改变(图2B-图2D)。Lin6在果实中表达量很低，在瞬时表达INH的过程中，Lin6在转录水平基本没有发生改变(图3)。INH在中果肉、胶质胎座和心室隔壁中的表达变化比较复杂，在菌液注射处理的各部分的表达变化不一(图4)。INH在注射转基因(p1300-2A11-INH)菌液后3 d，表达明显增加，是其他处理的数倍，主要是由于果实特异性启动子2A11发生作用，使INH只在果实中表达。

图2 Lin5在番茄果实注射3 d和5 d的表达变化 Figure 2 Relative expression levels of tomato Lin5 in Micro-Tom tomato fruit after Agroinfiltration treatment

图3 Lin6在番茄果实注射3 d和5 d的表达变化 Figure 3 Relative expression levels of tomato Lin6 in Micro-Tom tomato fruit after Agroinfiltration treatment

图4 INH在番茄果实注射3 d和5 d的表达变化 Figure 4 Relative expression levels of tomato Lin5 in Micro-Tom tomato fruit after Agroinfiltration treatment

Micro-Tom在注射EHA105菌液、注射pBI121-2A11菌液后蔗糖转化酶活性明显升高1倍左右，而注射p1300-2A11-INH菌液后3~5 d，蔗糖转化酶活性显著下降，尤其胶质胎座中最为明显，大约是注菌0 d的3倍。

2讨论
根癌农杆菌介导的基因瞬时表达法具有操作简单，周期短的特点，避免了繁琐的组织培养过程(Janssen and Gardner, 1990; Kapila et al., 1997)。进入植物细胞的大部分T-DNA并没有整合到植物的基因组中，而是暂存于细胞核内，具有很高的拷贝数；瞬时表达不受基因位置效应和基因沉默的影响(邱礽等, 2009; Wroblewski et al., 2005; Kapila et al., l997)。传统的转化系统需要抗生素或者其他的筛选基因进行初筛，即使这样也会出现假阳性的植株，给试验的结果分析带来不便，但根癌农杆菌介导的基因瞬时表达法不需要筛选基因的介入，就能得到准确可靠的结果，避免了转基因过程中需要抗生素筛选等带来的不安全因素；可以选择更小的载体来转化较大的目的片段或多个基因。本实验结果也表明利用农杆菌注射方法，可在注射后3~5 d检测到转基因产物的高效表达(图4)。

本研究的结果表明在注射空菌(EHA105)和空载体(pBI121-2A11)时，Micro-Tom果实中Inv的活性升高1倍左右。之前的研究发现，植物在被病毒侵染后作为营养物质的己糖的含量会快速上升，而这些己糖正好又是宿主抵御病原体所需要的(Herbers et al., 1996; Biemelt and Sonnewald, 2006; Seo et al., 2007)，因此降解蔗糖为己糖的Inv在抗病毒过程中发挥重要的作用。Scharte等(2005)发现，在被烟草花叶病毒侵染的烟草叶片的早期防御过程中，CWI被快速诱导。本研究结果中蔗糖转化酶活性在胶质胎座中最高，中果肉和心室隔壁中相差无几，这与Orzaez等(2006)的研究结果一致。同时齐红岩等(2005)的研究表明，番茄果实不同部位中Inv活性明显高于果实外各部位，以胶质胎座中AI活性最高，果蒂中AI活性次之，果肉、心室隔壁以及果实维管束中AI活性相差不大。

Hyun等(2011)利用番茄和灰霉病菌进行研究，结果表明在灰霉病的胁迫下，成熟果实中Lin5和Lin6的表达上调，而Lin7和Lin8的活性没有显著变化，同时灰霉病的感染导致了AI活性的提高。但本实验中Lin5随着空菌(EHA105)菌液和空载体(pBI121-2A11)菌液的注射处理表达量没有发生明显改变，这一结果还有待于进一步的研究探索。近几年来对INH已有了一些相关的研究，这些研究的结果都证明了INH可以在体外抑制Inv的活性(Greiner et al., 1998)。但当前缺乏验证INH在活体内对Inv活性抑制作用的相关实验证据。虽然Greiner等通过在马铃薯中过量表达烟草蔗糖转化酶抑制蛋白(NtVIF)，发现马铃薯块根中VI的活性有所降低，而且其块根中己糖的积累也随之减少，但是这些异源表达的研究结果并没有真正地说明内源的INH的功能。Jin等(2009)发现在番茄中抑制INVINH的表达，其成熟叶片中CWI的活性增加了40%~65%，果实和种子中CWI的活性则增加近1倍；但无论是在成熟叶片还是在果实及种子中，抑制INVINH的表达对Inv mRNA的含量都没有影响。本研究结果表明，在转录水平虽然瞬时增加INH基因的表达，但却没有影响细胞壁转化酶基因的表达。然而在生理水平(图5)检测却发现酸性转化酶活性在瞬时表达系统中发生明显的下降，说明INH基因在翻译成蛋白后存在翻译后水平对细胞壁转化酶基因的抑制作用。由于糖基化的修饰，CWI和VI相对比较稳定，所以这两类Inv的活性在很大程度上是依赖翻译后调控的(Greiner et al., 2000; Rausch and Greiner, 2004)。本实验中Micro-Tom果实在注射转基因(p1300-2A11-INH)菌液之后3 d，INH的表达明显增加，同时Inv的活性显著下降，尤其胶质胎座中最为明显，大约是注菌0 d的3倍。上述结果均表明蔗糖转化酶抑制子INH对Inv存在翻译后调控。

图5 蔗糖转化酶活性在果实注射3 d和5 d的变化 Figure 5 Relative expression levels of tomato Lin5 in Micro-Tom tomato fruit after Agroinfiltration treatment

3材料与方法
3.1植物材料
试验材料为栽培品种Micro-Tom番茄。在沈阳农业大学园艺学院北部科研基地日光温室内进行试验。50孔穴盘基质育苗，当幼苗长至2片真叶时将苗分装至直径为13 cm的营养钵内继续培养。

3.2实验方法
3.2.1农杆菌侵染液的制备
含质粒p1300-2A11-INH或pBI121-2A11根癌农杆菌EHA105的活化：分别挑取两种农杆菌单菌落，接到5 mL YEB液体培养基(含利福平100 mg/L和卡那霉素50 mg/L)中，28℃，200 r/min培养24 h。按1:50转接到50 mL YEB液体培养基(Rif 100 mg/L和Kan 50 mg/L, MES 10 mmol/L, AS 20 μmol/L和MgSO₄ 2 mmol/L, pH 5.6)中，28℃培养过夜。在4℃条件下，4 000 r/min离心10 min收集菌体，重新悬浮于MMA (含MES 10 mmol/L, MgCl2 10 mmol/L, AS 200 μmol/L, pH 5.6)中，调节OD600值为1.0，25˚C条件下200 r/min培养3 h以上。注射前再加入0.05%蔗糖和1~2滴0.005%的Tween-20。

3.2.2根癌农杆菌注射法介导的瞬时表达系统的建立
注射前1 d应将植物置于弱光下，并浇足水，使植物更适于注射。源叶注射：先选取源叶，用刀片将叶片背面的表皮划破，再取2 mL的一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，将注射器针口顶在叶片划破处，轻轻推动菌液，使菌液从破损处渗入并渗透扩展至整个叶片，每株番茄注射两片源叶，处理后植株进行适当保湿。分别取注射后0、1 d、3 d、5 d和7 d的源叶进行检测。果实注射：取花后22 d果实(绿果期)，参考Liu等(2002)方法。分别取注射后0、3 d和5 d的中果肉、胶质胎座和心室隔壁进行检测。以未注射0 d的果柄作为对照。每个处理3个果实。

3.2.3总RNA的提取
采用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒提取RNA。

3.2.4 RNA反转录cDNA
取50 ng~2 μg的总RNA，加入5 µL 2.5 mmol/L dNTPs、1 µL 10 µmol/µL Oligod(T)₁₅引物，彻底混匀后于65℃下变性5 min，-20℃迅速冷却2 min。再加入5 µL 5×M-MLV Reaction Buffer、1 µL M-MLV Reverse Transcriptase和1 µL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor，用RNase-free ddH₂O补充到25 µL，混合液于37℃下保温62 min，70℃下保温15 min。反转录得到的cDNA用于实时荧光定量分析

3.2.5实时定量PCR分析
本实验采用相对定量分析方法，将反转录的全部样品cDNA以Actin基因作为所有基因定量的内参基因(正向引物: 5’-TGTCCCTATTTACGAGGGTTATGC-3’; 反向引物: 5’-AGTTAAATCACGACCAGCAAGAT-3’)，采用AB (Applied Biosystems) 7500实时PCR系统和对应的7500 software v2.0.1软件结合2ΔΔCT法进行分析，每个处理均重复3次。PCR反应体系为20 µL，包含9 µL 2.5×Real MasterMix/20×SYBR溶液、正向和反向引物各加入1 µL (2 µmol/L)、2 μL cDNA和7 μL灭菌双蒸水。实时定量的PCR反应采用热启动模式：首先在95℃下变性3 min；然后进行40个以下循环：95℃下变性30 s、57℃退火30 s、68℃延伸1 min，在每次循环的第3步设定荧光采集，绘制每个基因的融解曲线。根据Genbank中所登录的番茄蔗糖转化酶基因家族及抑制子的cDNA序列，利用DNAMAN 5.0软件进行引物设计，引物序列见表1。

表1 番茄蔗糖转化酶基因家族及其抑制子实时荧光定量PCR所用引物 Table 1 Primers of tomato Inv gene families and INH used for real-time fluorescence quantitative (real-time quantity) RT-PCR

3.2.6蔗糖转化酶活性的测定
蔗糖转化酶的提取采用王永章等(2001)方法进行。活性测定参照Balibrea等(2008)的测定方法基础上加以改进：在0.8 mL反应液(pH4.8的0.1 mol/L Na₂HPO₄ 0.1 mol/L柠檬酸钠，0.1 mol/L的蔗糖)中加入0.2 mL酶液，37℃反应30 min，测定生成的还原糖含量，酶活性单位用Glucose µmol/h•g FW表示。

3.3数据处理
所有数据均采用Excel 2003进行处理，统计分析用DPS 2000软件进行，作图采用OriginPro7.5软件进行。

作者贡献
张月丽是本研究的实验设计和实验研究的执行人；杨艳丽参与实验实施，试验结果分析；姜晶是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(30971999)和辽宁省重点实验室项目(2009S092)共同资助，在此表示感谢。

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