中国是荔枝(Litchi chinensis Sonn.; 2n=30)原产国，也是全球闻名遐迩的荔枝主产国，种植面积及产量分别约占世界的80%和75%。但是，近十年来，荔枝产业发展陷入低谷，产品销路不畅和季节性过剩等问题突显，与良种覆盖率低、品种结构不合理不无相关，荔枝品种改良与品种结构调整已成为荔枝产业可持续发展的迫切需要。

迄今为止，荔枝遗传改良仍旧处于依赖实生选种的阶段，由于育种研究起步晚，系统理论欠缺，技术手段落后，荔枝品种改良的历史就是实生选种的历史，内地省份现有的20多个主栽品种基本都来自实生变异(刘成明等, 2004, 中国南方果树, 33(2): 36-40)。中国荔枝种质资源丰富，长期栽培及不同品种混栽的现实导致大量的变异产生，从这些实生变异中选育优质、丰产稳产、具有特殊性状的荔枝新品种，仍是目前及今后相当长时间内育种工作者的重要目标及育种手段。

1997年，珠海市果树科学技术推广站的技术员于广东省珠海市斗门镇斗门乡斗门村发现一株树龄达50年以上的实生大树，因其品质上乘，被当地农户争相嫁接或圈枝繁殖。近十年，繁殖后代陆续进入挂果期，表现丰产稳产、果色鲜美、风味特别，在当地广受消费者喜爱。一般年份售价在60元/kg以上，较当地名优品种桂味和糯米糍的售价高50%以上。近几年，我们对其植物学与经济性状进行连续观察。从植物学性状如树冠、枝条、叶片和花的性状上看，该种质与品种怀枝极为相似；但果实性状却明显不同于怀枝，此种质焦核率高(80%)且稳定，品质也远超怀枝，并略超过桂味和糯米糍，初步判断该种质为一全新的种质。此外，由于其出自珠海著名的“御温泉”地质带，初步定名为御金球。经农业部质量检测中心检测，该种质具有最高的可食率(84.9%)、较高的总糖(16.9%)、可溶性固形物(19.9%)和VC含量(0.35 mg/g)，及较低的可滴定酸含量(0.09%)。且因其极少裂果，产量也可比怀枝，是一份不可多得的优异种质，应具有较大的推广应用价值和潜力。但从遗传的角度，该种质是否为一份新种质及其亲本来源都需要深入的分析和验证，以获得分子证据的确凿支持。

如何鉴别果树种质的亲本来源，长期以来都是困扰育种工作者的难题，也是分子育种首先要解决的问题。开发并利用特异性强的分子标记进行分析鉴别，应是目前最可靠也最有应用前景的技术路线。因此，本研究以自主开发的荔枝SNP和EST-SSR分子标记，对近年来发掘的荔枝种质御金球开展相关分析，以探索该种质是否为一份新种质及其遗传背景的分子证据；特别是将最新一代的SNP分型技术用于亲本来源的鉴别中，以期评价SNP分型技术在荔枝种质鉴别中的有效性，也为今后荔枝选育种工作中种质鉴别、新品种鉴定提供高效的技术分析平台。

1结果与分析
1.1御金球与现有363份荔枝种质的亲缘关系
13对EST-SSR引物(表1)在供试的364份种质中共产生122条谱带，其中多态性条带112条，多态性比例为91.8%。御金球与其他种质的遗传相似性系数介于0.123 0~0.877 0之间，可见，御金球不同于其他363份荔枝种质。从364份种质中选择不同来源的92份种质与御金球进行聚类分析(表2; 图1)。从图1的聚类结果可以看出，93份资源多样性非常丰富，13对EST-SSR引物可以将93份种质完全区分开。在遗传相似性系数为0.83时，御金球与红灯笼首先聚到一起，再次与灵山香荔、乌叶舅聚为一类。

表1 所用的13对EST-SSR引物特征 Table 1 Information of 13 EST-SSR primers used in this study

表2 93份荔枝种质 Table 2 Information of 93 litchi accessions used in this study

图1 93份荔枝种质的EST-SSR的UPGMA聚类分析 Figure 1 Dendrogram for the 93 litchi accessions by UPGMA approach based on EST-SSR data

从50对SNP引物中筛选出17对扩增效率高、分型效果明显的SNP引物(表3)。利用这些引物对御金球与现有363份荔枝种质进行亲缘关系分析。结果表明，17对SNP引物均表现为二等位性，御金球与其它363份荔枝种质的演化分化系数介于0.043~1.924之间，可见SNP分型同样证明御金球是一份新种质。利用17个SNP位点对御金球与挑选出的92份荔枝种质进行聚类分析(图2)。结果表明，17个SNP位点将93份材料初步分成4大类，这些SNP位点未能将所有的材料区分开，如早蜜与99-1，新球蜜荔与玉潭蜜荔，广东来源的胭脂红和广西来源的胭脂红等。虽然93份材料没有被完全区分开，但御金球有别于其它92份种质，图2聚类分析显示与其遗传距离最近的是糯米糍和苏州荔。

图2 御金球及其他92份荔枝种质的17对SNP引物的聚类分析图 注: 93份荔枝种质名称参照表2

表3 17对SNP引物特征 Table 3 Characteristics of the 17 SNP primers used in this study

1.2御金球与22份疑似亲本种质的亲缘关系分析
选择22份御金球的疑似亲本种质，其中包括3份胭脂红种质(由于在斗门当地将御金球命名为胭脂红,所以本研究分别从广东、广西和云南省收集了胭脂红种质)，对其进行EST-SSR和SNP分子标记鉴定分析。EST-SSR分析表明，御金球与22疑似亲本的相似系数为0.459 0~0.844 3。从图3可以看出，御金球与糯米糍的亲缘关系最近(相似系数为0.844 3)，随后与红灯笼聚到一起，并最终与怀枝类(同沙迟怀枝, 焦核怀枝和怀枝)聚到一起；而与广东、广西和云南来源的胭脂红并未首先聚到一起。可见，御金球不同于胭脂红，而是与糯米糍及怀枝类型的种质更相似一些。

图3 基于EST-SSR标记的的UPGMA聚类分析图 Figure 3 Dendrogram of Yujinqiu and the 22 suspected parents by UPGMA approach based on EST-SSR

SNP分析与EST-SSR的鉴定结果相似。御金球与22份疑似亲本种质的演化分化系数介于0.088~1.804之间，其中，与糯米糍的分化系数最小(0.088)，与三月红的分化系数最大。图4的聚类分析同样表明，御金球与糯米糍的亲缘关系最近，来自广西和广东的胭脂红与红灯笼和焦核怀枝首先聚在一起后，才与糯米糍和御金球这一分支聚到一起。

图4 基于SNP标记的御金球及其22份疑似亲本的UPGMA聚类分析图 Figure 4 Dendrogram of Yujinqiu and the 22 suspected parents by UPGMA approach based on SNP loci

1.3御金球的亲本来源鉴别
利用17个SNP位点对御金球及其22份疑似亲本进行等位基因型检测。判定亲本的的标准为一个位点的二等位基因中，只要有一个等位基因与御金球的相同，该材料即为御金球的推测亲本。依据该判定标准，将表4中的各疑似亲本进行比较排除。从表4中可以看出，在22份疑似亲本种质中，只有焦核怀枝和红灯笼的17个SNP位点表现为二等位基因或其中一个等位基因与御金球完全相同，因此这两个品种为御金球的推测亲本；其余种质与御金球存在1~12个SNP位点的差异，其中三月红具有12个位点与御金球完全不同，水东和妃子笑分别有三个位点完全不同于御金球，黑叶有4个不同位点，桂味、雪怀子、白蜡及来自广东和广西的胭脂红分别有3个不同位点，水晶球、红绣球和紫娘喜各有2个不同位点，糯米糍、同沙迟怀枝、怀枝、双肩玉荷包、增城挂绿、白糖罂、无核荔和云南的胭脂红都各有一个SNP位点不同于御金球。

此外，在SNP35这个位点上，御金球为杂合型AG，焦核怀枝为AA。表4可以看出，糯米糍(GG)和红灯笼(AG)在该位点可能成为其另一个亲本来源，但从起源时间上判断，红灯笼母树树龄远小于御金球母树树龄，因此可排除红灯笼是御金球亲本来源的可能。结合亲缘关系分析，本研究推测御金球是来源于以糯米糍为母本、焦核怀枝为父本的有性杂种后代。

2讨论
EST-SSR、SNP等分子标记是近年开发的两类特异性强的遗传标记。EST-SSR是基于EST文库开发的新型SSR标记，不同于传统的基因组SSR(gSSR)标记，除具有遗传稳定、多态性高、检测迅速和操作简便等优点外，还反映了基因的外显子区段，可以直接获得基因表达的信息，这就有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定(Chen et al., 2006)，目前，已广泛应用于植物遗传资源研究中(Han et al., 2006; Jung et al., 2010; Yu et al., 2004; Jiang et al., 2006, Yichuan Xuebao, 33(4): 345-353; 王西成等, 2010; 向旭等, 2010)。SNP即为单核苷酸多态性标记(Single nucleotide polymorphism)，是指由同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异或者小的插入、缺失等变异所造成的一种DNA序列的多态性(Deleu et al., 2009)，近年来，随着高通量测序技术的广泛应用，大量的SNP位点被发掘，SNP分子标记技术也获得较快的发展，因其在基因组中数量最多、分布最广及具有双等位基因等特点，已经成为当前品种鉴定的有效手段和重要发展趋势。高分辨率熔解曲线技术(high resolution melting, HRM)由于具有高通量、快速、准确、分析简单等优点已被广泛用于人类致病基因突变的SNP分型诊断中(Montgomery et al., 2010; 卢永平等, 2010)，近年也被成功地运用于植物的基因分型、品种鉴定等研究中(Koeyer et al., 2009; Deleu et al., 2009; Wu et al., 2009)，在果树如葡萄、柑桔、猕猴桃等上已有成功应用的报道(Cabezas et al., 2011; 吴波等, 2012; 周锦等, 2011)，本研究首次将SNP基因分型技术成功地用于荔枝的品种鉴定中来。

前人的研究表明，SNP的共显性及二等位的特点使得SNP成为一种较为有效的鉴定品种亲本来源的分子标记技术(Koeyer et al., 2009; Wu et al., 2009)。分析结果表明，SNP分型技术还需要与品种的起源信息相结合，比如仅从17个SNP位点(表4)看，焦核怀枝和红灯笼均可能为御金球的亲本之一，但却无法判定；从农艺性状如叶片形状上看，二者与御金球都很相似，但从品种的起源信息看，焦核怀枝是一个起源较早的品种，但红灯笼母树树龄尚不足30年，其母树苗木来源于广东省东莞市大朗镇水平乡，属于实生变异，可能为怀枝的自交后代(向旭等, 2010)；而御金球来自于广东省珠海市斗门镇斗门村，其母树应有50年生以上。御金球的起源早于红灯笼，红灯笼即不可能为御金球的亲本；由此可以判定，焦核怀枝是御金球的亲本之一。尽管红灯笼不是御金球的亲本，本研究依据EST-SSR和SNP的结果可以推测，御金球与红灯笼可能是姊妹系。那么，御金球到底是由焦核怀枝自交产生，还是其与其它品种杂交产生的后代呢？将二者的SNP位点进行比对发现：在SNP35这个位点上，焦核怀枝为AA，而御金球为AG；御金球在该位点的杂合型表明其并非是焦核怀枝的自交后代，而是焦核怀枝与其他品种杂交产生。那么，哪个品种是其另一个杂交亲本呢。本研究对22个疑似亲本进行比较，发现在SNP35这个位点上，只有糯米糍(GG)和红灯笼(AG)可能成为其亲本来源，但红灯笼已经被排除，所以只有糯米糍成为其亲本的可能性最大。结合EST-SSR和SNP的亲缘关系远近分析，两类标记的结果均表明，御金球与糯米糍的亲缘关系最近。因此，本研究认为糯米糍是御金球的母本，焦核怀枝是其父本，并且在SNP24这个位点上御金球发生了突变。

表4 御金球及其22份疑似亲本的17对SNP引物分型 Table 4 Genotyping of Yujinqiu and 22 suspected  parents by 17 SNP loci

本研究首次将SNP分型技术运用于荔枝的品种鉴定，是在荔枝育种技术上的全新尝试。鉴定结果表明，基于HRM的SNP分型技术可以成功地用于荔枝新品种鉴定，为未来的荔枝品种的鉴定与保护、杂种后代的早期预选与区分、种质资源间亲缘关系分析、起源进化研究均提供了良好的借鉴。

3材料与方法
3.1实验材料
本研究所用实验材料共364份(表5)，其中，需鉴定的荔枝新种质御金球取自广东省珠海市斗门镇斗门村，53份来自广西省园艺所，29份来自福建省漳州综合试验站，38份来自云南省保山综合试验站，其余种质均取自广东省农科院果树研究所的国家荔枝种质圃。于2010年5月-10月间从上述样品来源地采集荔枝叶片，采用改良的CTAB法(Puchooa, 2004)提取基因组DNA，并利用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪(Nanodrop ND-2000)检测DNA质量及浓度。

表5 364份荔枝种质名称及来源 Table 5 Names and origins of 364 litchi germplasms used in this study

3.2 EST-SSR检测
引物来源：引物序列来自孙清明等(2011)，从中挑选13对多态性高、扩增稳定的EST-SSR引物用于种质分析(表1)。

PCR反应：使用Biometra PCR仪进行PCR扩增。10 μL反应体系包括：10~20 ng基因组DNA，1×Buffer (含Mg²⁺)，0.3 U rTaq DNA聚合酶(Takara)，0.2 mmol/L dNTPs，0.25 mmol/L正、反向引物。扩增程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 min，28个循环；72℃ 5 min。采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压150 V, 时间2 h)进行PCR产物分离，电泳槽型号：DYCZ-24A (六一仪器厂, 北京, 中国)，电泳缓冲液(1xTBE)，参照McCouch等(1997)的方法进行银染显色。
数据分析：利用NTSYS 2.10e软件进行相似性数据分析，采用SM系数计算种质之间的相似性系数，进行UPGMA 聚类。

3.3 SNP检测
引物设计：将前期获得的两个荔枝品种的转录组数据进行比对，从中发掘SNP位点，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，设计原则：引物3′末端尽可能靠近SNP位点，产物长度36~60 bp，避免引物二聚体和二级结构形成，Tm值50℃~60℃，为方便后续试验操作，本试验中所有引物的Tm值均设定为(55±1)℃，具体引物信息见表3。此外，使用Tm 60℃和90℃的内参序列作为内参进行温度校正，以抵消96孔板上各孔之间可能存在的温度差异。两条序列分别为5’-TTAAATTATAAAATATTTATAATATTAATTATATATATATAAATATAATA-C3-3’和5’-GCGCGGCCGGCACTGACCCGAGACTCTGAGCGGCTGCTGAGGTGCGGAAGCGGAGGGGCGGG-C3-3’及各自的反向互补序列，内参序列的3’羟基末端均引入3碳烷基(-C3)修饰以阻止内参链在PCR过程中延伸(Gundry et al., 2008; 吴波等, 2012)。

PCR反应：利用Biometra PCR仪进行PCR扩增，PCR反应体系10 μL：20 ng基因组DNA，0.3 U rTaq DNA聚合酶(Takara)，1×Buffer (含Mg²⁺)，0.2 mmol/L dNTP，300 nmol/L正、反向引物，100 nmol/L内参序列(4种)，1×LC-Green Plus (Idaho Technology Inc.)。PCR扩增程序：变性(95℃ 3 min)；50个扩增循环(95℃ 15 s, (55±1)℃ 10 s, 72℃ 8 s)；变性、复性(94℃ 30 s, 28℃ 30 s)。

HRM检测及数据分析：利用Light Cycler(Spectron)进行HRM检测，Light Scanner96软件进行数据分析，具体参照使用说明书(www.idahotech.com)。利用MEGA5中的Align进行序列比对, UPGMA进行种质间系统演化分析, 并计算演化分化系数。

作者贡献
方静、杨晓燕、马帅鹏和马文朝是实验研究的主要执行人；李永忠和陈道明参与完成数据分析；吴绪波和周东辉参与实验结果分析；向旭和孙清明是本研究的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31272135, 30900980)、广东省现代农业产业技术体系岭南水果创新团队荔枝遗传育种与改良岗位及广东省自然科学基金项目(9451064001003535, 10151064001000017)共同资助。

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