甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)是生物膜中最主要的成分—磷脂酰甘油(PG)生物合成过程中的第一个酰基酯化酶，它催化甘油-3-磷酸分子sn-1位的酯化反应，形成溶血磷酯酸(lysophosphatidic acid, LPA)，从而启动三酯酰甘油的合成(Roughan and Slack, 1982; Murata et al., 1992; Murata and Tasaka, 1997)，它对底物酰基的选择性决定了类囊体膜磷脂酰甘油(PG)中顺式不饱和脂肪酸的含量(Nishida and Murata, 1996)，所以甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)对于增强植物抗寒能力具有重要的作用。GPAT基因在植物抗冷性中的正向作用已被证实，Yokoi等(1998)通过根癌农杆菌介导并用玉米Ubiquitin作为启动子把拟南芥的GPAT基因导入水稻，提高了水稻叶片类囊体PG的不饱和脂肪酸含量，增强了水稻的抗冷性。Ariizumi等(2002)将菠菜和拟南芥的GPAT基因分别转入水稻中，使水稻叶片中磷酸甘油的顺式不饱和脂肪酸含量从19.3%分别上升到了32.0%和29.4%，水稻抗冷能力也相应提高。GPAT基因功能的研究至今仍是一个有意义的课题。

目前已从许多植物中克隆了GPAT基因的cDNA或DNA片段(Weber et al., 1991; Nishida et al., 2000; Manaf and Harwood, 2000; Zheng et al., 2003)，全长cDNA序列的获得是进行基因功能研究的必要基础和前提。前期研究中，本课题组从毛百合中分离得到GPAT蛋白编码基因的核心片段(陈丽静等, 2011a)，并通过冷胁迫下GPAT酶活性变化和基因表达量的变化证实该基因与百合的抗寒性密切相关，低温可以诱导百合GPAT基因快速表达，表达量随着冷诱导时间的延长呈现先升高后降低的趋势，16 h时达到峰值，基因的持续表达时间不低于48 h，与冷胁迫下酶活性变化的结果一致(陈丽静等, 2011b)。到目前为止，有关百合甘油-3-磷酸酰基转移酶GPAT的基因全长序列和基因结构的分子特征未见报道。

本研究拟从毛百合中分离克隆GPAT蛋白的编码基因全长，并对其进行序列、结构和系统进化的生物信息学分析，以了解毛百合GPAT蛋白的基因结构及其分子特征，为进一步研究其GPAT基因的功能奠定基础。

1结果与分析
1.1 LiGPAT基因3’末端的克隆
利用T17AP进行反转录得到毛百合的第一链cDNA，设计3’RACE的特异引物，进行巢式PCR扩增，最佳退火温度为55℃。毛百合3’RACE扩增结果如图1所示。

图1 毛百合3’RACE产物 注: M: DL2000 DNA maker Figure 1 The products of 3’RACE in L. pensylvanicum Note: M: DL2000 DNA marker

图1显示了毛百合扩增出777 bp的目的片段，TA克隆测序(图2)得到毛百合的3’末端序列，将该序列在NCBI上进行BLAST分析，结果显示3’RACE扩增出的片段序列与植物GPAT基因的同源性较高，确定为百合中GPAT基因的3’序列。

图2 LiGPAT 3’RACE序列 Figure 2 3’RACE sequence of LiGPAT

1.2 LiGPAT基因5’末端的克隆
用Primer 5.0软件设计5’RACE的特异引物，以毛百合RNA为模板，以GSP51为引物，通过RT-PCR得到第一链cDNA，进行5’RACE，结果如图3所示：扩增出了一条496 bp的基因片段。测序结果(图4)经BLAST比对，结果显示扩增出的片段为GPAT基因。

图3 毛百合5’RACE产物 注: M: DL2000 DNA maker Figure 3 The products of 3’RACE in L. pensylvanicum Note: M: DL2000 DNA marker

图4 LiGPAT 5’RACE序列 Figure 4 5’RACE sequence of LiGPAT

1.3 LiGPAT基因全长的克隆
将3’RACE和5’RACE序列与已发表的毛百合GPAT基因保守区序列进行拼接，得到1 544 bp的基因序列，命名为LiGPAT。3’RACE和5’RACE与保守区序列分别有226 bp和247 bp的碱基重复。将拼接得到的毛百合LiGPAT基因经DNAMAN分析，找到起始密码子和终止密码子，发现是一个具有完整编码区的cDNA，初步分析得出5’-UTR 10 bp，3’-UTR 311 bp，开放阅读框ORF 1 233 bp，其中3’-UTR末端有19 bp的poly(A)，编码410个AA，预测分子量为45.9 kD (图5; 图6)。

图5 LiGPAT全长cDNA示意图 Figure 5 Schematic diagram of the full length cDNA of LiGPAT

图6 LiGPAT全长cDNA序列 注: 方框内为5’和3’与保守区的重复序列 Figure 6 Sequence of the full length cDNA of LiGPAT Note: Sequences in the box were the repeats between conserved region and 5’ and 3’ region

1.4 LiGPAT的同源性分析
利用DNAMAN软件将毛百合GPAT氨基酸序列与其它19种植物的GPAT氨基酸序列进行多序列比对，多序列同源性比对发现，LiGPAT氨基酸与其它已知的19种植物GPAT氨基酸序列有48.20%~67.17%的一致性，其中与油棕GPAT氨基酸序列的一致性最高，达到67.17%；与番茄GPAT氨基酸序列的一致性最低，为48.20% (表1)。从表1可以看出，LiGPAT基因编码的氨基酸序列与其它19种植物GPAT基因编码的氨基酸序列存在较大差异。

表1 LiGPAT基因和已知其它19种植物的GPAT基因推导的氨基酸序列相似性比较 Table 1 Alignment of LiGPAT and other 19 plants GPAT andamino acid in GenBank

1.5 LiGPAT基因系统发育树分析
为了进一步研究不同物种GPAT蛋白之间的进化关系，使用Clustalx 1.83软件和MAGE5.1软件(Tamura et al., 2011)进行聚类分析结果如图7。结果显示：毛百合GPAT与油棕(Elaeis guineensis)、水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)先聚类，再与沙棘(Hippophae rhamnoides)、甜椒(Capsicum annuum)、番茄(Solanum lycopersicum)、南瓜(Cucurbita moschata)、黄瓜(Cucumis sativus)等后聚类。聚类分析结果表明，本研究所克隆出来的LiGPAT基因与单子叶植物的GPAT基因亲缘关系更近，与双子叶植物GPAT基因更远一些，这样的分类也与传统的植物分类基本相一致。

图7 不同来源的GPAT基因推导的氨基酸序列聚类分析结果 Figure 7 The amino acid sequences of GPAT from Lilium pensylvanicum and other plants in GenBank database

1.6 LiGPAT基因编码的蛋白质结构功能域分析
利用在线软件SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)分析LiGPAT基因编码的蛋白质的结构功能域，结果如图8所示。采用HMMER程序搜索SMART数据库，结果表明该蛋白在176位到322位存在一个PIsC结构域(P=0.000 010 7)。PIsC结构域是磷酸酰基转移酶结构域。具有磷脂的生物合成功能，并且具有磷酸甘油、1-酰基磷酸甘油和酰基甘油磷酸乙醇胺酰基转移酶活性。

图8 在线工具SMART服务器预测毛百合LiGPAT蛋白质结构域 Figure 8 Protein domains of LiGPAT predicted by online tools SMART server

2讨论
甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyltransferase, GPAT)是磷脂酰甘油(PG)生物合成的关键酶，其主要作用是催化18:1-ACP或16:0-ACP转移到甘油-3-磷酸的Sn-1位上，合成1-酰基-Sn-甘油-3-磷酸(溶血磷脂)，许多关于GPAT与植物的抗寒性关系的研究仅局限于模式生物或蔬菜作物(Frentzen et al., 1983; Nishida et al., 1993; Sui et al., 2007)，在花卉中的研究还很少见，在百合中未见相关报道。

本研究在百合中获得的GPAT全长氨基酸序列与已知植物的相似性与陈丽静等(2011a) GPAT保守区氨基酸序列与已知植物的相似性相比要低，说明GPAT基因虽然在植物中比较保守，但是不同植物中该基因全长的差别还是较大的。

本文利用MEGA4.1软件对LiGPAT和其它19种植物的GPAT基因编码的氨基酸序列构建的系统发育树发现，毛百合GPAT与单子叶先聚类，与双子叶后聚类，这就说明LiGPAT基因编码的氨基酸与单子叶植物GPAT基因编码的氨基酸序列在进化上的关系近，而与双子叶植物GPAT基因编码的氨基酸序列在进化上的关系远，这与传统的植物分类是一致的。

本研究利用在线软件SMART分析LiGPAT基因编码的氨基酸时发现在176~322位氨基酸残基之间有一个PlsC结构域，甘油-3-磷酸酰基转移酶的催化位点均在这一区域，那么为何不同植物GPAT具有差异性和不同植物中GPAT基因的功能是否相同及该基因在各物种中如何调控表达是我们进一步研究的目标。

3材料与方法
3.1植物材料
毛百合(Lilium pensylvanicum)由内蒙古大兴安岭阿尔山市白狼林业局提供，由野生种驯化3年得到，花橙红色或者红色有紫红色斑点，外披白色绵毛，喜阳光，极耐严寒，冬季覆土10 cm贮存，种球可耐-50℃低温。

3.2引物设计与毛百合总RNA的提取
使用Primer 5.0软件根据已克隆的毛百合GPAT基因中间保守区序列(Genbank登录号为HQ654523) (陈丽静等, 2011a)设计3’RACE和5’RACE特异引物。引物序列见表2，由赛百盛生物工程公司合成。
 采用RNAprep pure Plant Kit植物总RNA提取试剂盒提取毛百合总RNA。

表2 毛百合LiGPAT引物序列 Table 2 Primer sequence of LiGPAT in L. pensylvanicum

3.3 3’RACE
以毛百合试管苗叶片总RNA为模板，T17AP为引物，按照Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase说明书，合成第1链cDNA。以合成后的3’加尾第1链cDNA为模板，GSP31、GSP32、GSP33及3’接头引物T17AP进行巢式扩增，最终得到单一清晰的3’目的片段。

3’RACE反应体系(25 μL)：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L Mg²⁺ 1.2 μL，dNTP mixture (10 mmol/L) 0.4 μL, T17AP (10 μmol/L) 1 μL，GSP31/GSP32/GSP33 (10 μmol/L) 1 μL，cDNA/第一轮产物/第二轮产物2 μL，Taq DNA polymerase 0.4 μL，ddH₂O 16.5 μL。反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s；55℃ 60 s；72℃1 min 20 s；35 cycles；72℃ 10 min。
PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，将目的条带切胶回收后TA克隆测序。

3.4 5’RACE
以GSP51为引物，通过反转录PCR得到第一链cDNA。用RNase H消化25 μL第一链cDNA，去除残留的RNA。纯化cDNA，利用TdT试剂盒进行5’加尾，在cDNA的5’端加上polyC。利用特异引物GSP52与AAP进行第一轮扩增，以得到产物为模版，分别以GSP53、GSP54和 AUAP做引物，进行巢式扩增从而得到该基因的5’端片段。

PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，将目的条带切胶回收后TA克隆测序。

3.5毛百合GPAT基因的生物信息学分析
利用DNAman 5.2.2 (http://www.lynnon.com/)软件对测序结果进行氨基酸序列翻译，利用DNAMAN和DNAUSER进行序列拼接；基因编码区用ORF Finder程序预测(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi/)；引物设计采用Primer Premier 5.0软件；核苷酸和氨基酸同源序列搜索通过NCBI中在线BLAST进行(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)，使用Clustalx 1.81软件进行同源性比对分析；并在MEGA 4.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis, version 4.0) software软件中采用Neighbor-Joining法构建系统进化树进行分析。利用在线工具SMART (http://coot.emblheidelberg.de/SMART/)分析预测百合LiGPAT蛋白质的结构域。

作者贡献
相恒佐和苗琰是本研究的实验设计和实验研究的执行人；相恒佐和王利完成数据分析；张丽、林景卫和赵兴华参与实验设计和试验结果分析；陈丽静、相恒佐完成论文写作与修改；陈丽静和李天来是项目的构思者及负责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由中国博士后科学基金面上项目(20100- 471471)、高等学校博士学科点专项科研基金联合资助课题(20112103120005)和沈阳农业大学研究生创新培育项目共同资助。

参考文献
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