防风(Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.)是伞形科多年生草本植物，其干燥根是中国常用的中药材，味辛甘，性温，能解表祛风，胜湿，止痉，用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风。防风含香豆素，色原酮，有机酸，挥发油等多种药用化学成分，已从生药防风中分离出来的各种化学成分达100种以上(高凤兰等, 1990, 黑龙江中医药, (3): 46)，朱惠京等(1998)研究了防风正乙醇萃取物具有抗凝血作用，李莉等(1999)研究表明防风多糖具有抗肿瘤的作用，可见防风蕴藏很高的医用价值，具有很大的潜在市场。

防风主产于中国东北和华北地区，黑龙江省以杜尔伯特蒙古族自治县为中心的西部草原地区是中国最大的防风产区，中药界认为其品质优良，特称“小蒿子防风”，在产量和质量方面均居于全国首位(王建华和楼之岑, 1992, 中国药学杂志, 27: 323-328)，但由于连年滥采滥挖，野生防风资源已近枯竭，现多采用人工栽培，药材市场现将种植在东北地区及内蒙古东北部产品称“关防风”，品质最好。随着医药业的发展，市场对关防风的需求量不断增加，而栽培品种又易受环境条件影响，很多出现退化，质量不高，故建立其组织培养再生体系，优化组培条件就显得尤为重要。张家菁等(2012)比较了不同防风外植体对诱导愈伤组织的影响，初步建立了防风的再生体系，但在组培过程中出现了普遍的试管苗玻璃化现象，使组培苗的产量和质量降低。
本研究以关防风为试材，在初步建立的防风组培体系基础上进行完善，研究有效抑制组培苗玻璃化问题的方法，使其组培体系趋向完善，为实现工业化生产和进一步科学研究奠定理论与技术基础。

1结果与分析
1.1防风再生体系的建立
1.1.1不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
防风茎段暗培养7 d后，其两端开始膨大，接种两周后，膨大长出少量黄绿色颗粒状愈伤组织，继续培养两周后，在绝大多数培养基中都能观察到较多的愈伤组织。防风茎段在12号培养基上诱导率最高，可达96.7%，是最佳诱导培养基(表1)。

表1 激素组合对愈伤组织诱导的影响 Table 1 Influence of phyto-hormone on callus tissue induction

1.1.2激素组合对愈伤继代的影响
将初代培养的愈伤接种到不同继代培养基中，发现愈伤组织在6号增殖培养基上增殖倍数最高，达5.8 (表2)。但是这种愈伤呈黄白色，分化培养时出芽率低。综合分析认为，MS培养基中附加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA时，愈伤组织质地紧密，呈黄绿色，后期出芽率较高，最适合防风愈伤组织的继代培养。

表2 激素对愈伤组织继代的影响 Table 2 Influence of different plant hormone on callus tissue subculture

1.1.3激素组合对不定芽诱导的影响
将生长较好继代培养的愈伤组织接种于不同的分化培养基中，培养1周后，部分愈伤组织分化出许多致密而平滑、颜色多为黄绿色的突起，2周后可以看见绿色的芽点，1个月左右有丛生芽形成。

经方差分析，处理5与其它处理的间差异达极显著水平，再生苗的分化率最高(75%)，玻璃化率较低(表3)。即MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为诱导不定芽的最佳培养基。

表3 不同激素组合对再生苗诱导的影响 Table 3 Effects of different growth regulators on seedling regeneration

1.1.4激素组合对生根的影响
当丛生苗转移至各生根培养基上，培养约15 d，芽基部开始出现白色的小突起，然后长成白色的根，随后根的数量逐渐增多。

各培养基均能诱导出根，但其诱导率和生根情况差异较大，其中5号培养基的诱导率最高，达65.0%，长出的根数也最多，平均为16.3条，且根的质量好(表4)。

表4 不同培养基及激素组合对生根的影响 Table 4 Effects of different growth regulators on growth of root

多重比较结果表明，生根最佳培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。

1.1.5移栽基质对试管苗成活率的影响
不同基质对试管苗移栽成活率影响很大，其中，试管苗在腐殖土:蛭石:河沙(1:1:1)的基质中移栽成活率最高，达92% (表5)，与其它处理间差异达极显著水平，是最理想的移栽基质。

表5 不同基质对试管苗移栽成活率的影响 Table 5 Effects of different transplanting medium on plantlet survival rates

图1 防风的再生体系 Figure 1 the regeneration system of Saposhnikovia divaricata

1.2防风试管苗玻璃化成因研究
1.2.1玻璃苗与正常苗在形态特征上的差异
玻璃苗植株矮小肿胀，茎叶内充满水分，呈水晶透明状，有不同程度失绿，多见黄绿色或白绿色的玻璃化芽。根据玻璃化等级不同可出现卷曲﹑肥厚﹑膨大等多种形态，组织脆弱易碎。玻璃苗很难生根，再培养多渐枯萎坏死。以下为防风玻璃化苗与正常苗比较(图2)。

图2 玻璃化苗和正常苗 Figure 2 Vitreous plantlets and normal plantlets

1.2.2玻璃苗与正常苗在水分及叶绿素含量上的差异
对防风玻璃苗与正常苗的水分及叶绿素含量进行比较发现(表6)：防风玻璃苗的组织含水量比正常苗增加了6.64%；叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量出现显著下降，较正常苗分别降低了62.88%、59.74%和63.98%，而叶绿素是与光合作用有关的重要色素，可见，防风玻璃苗水分生理功能异常，光合作用受到影响。

表6 玻璃苗与正常苗在水分及叶绿素含量上的差异 Table 6 Differences of water, chlorophall between vitreous and normal plantlets

1.2.3玻璃苗和正常苗的过氧化物酶电泳分析
过氧化物酶是植物体内普遍存在的，活性较高的一种酶。它与呼吸作用，光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

由防风组培正常苗和玻璃苗的同工酶电泳图谱可以看出(图3)，正常苗和玻璃苗的过氧化物酶同工酶谱存在明显的差别，正常苗有5条带，其Rf值分别为0.150、0.179、0.300、0.372和0.688；玻璃苗与正常苗相比有较多次生带，其中Rf值在0.300和0.372的两条酸性区带明显减弱。此结果说明，玻璃苗的生理代谢功能已发生很大变化，控制过氧化物酶的基因表达情况与玻璃苗形成密切相关。

图3 玻璃苗和正常苗过氧化物酶同工酶电泳比较 Figure 3 Comparison of POD isozyme electrophoresis between vitreous and normal plantlets

1.2.4不同环境因子对试管苗玻璃化率的影响
1.2.4.1 6-BA浓度的影响
6-BA作为细胞分裂素，在组织培养中的主要作用是促进细胞分裂扩大，诱导芽的分化。

不同浓度的6-BA对防风玻璃化发生频率的影响显著(表7)，4号培养基的玻璃化程度最高，与其它处理间达到显著水平。处理1的玻璃化率最低，为8.3%。可见，6-BA浓度越高，玻璃化程度越高。但6-BA浓度过低时，芽分化率也明显降低，并且芽生长缓慢。因此细胞分裂素6-BA浓度宜采用1.0 mg/L左右。

表7 6-BA浓度对玻璃化的影响 Table 7 Effect of 6-BA concentration on vitrification

1.2.4.2琼脂浓度的影响
琼脂是组织培养中普遍应用的凝固剂，培养基中添加的琼脂浓度直接影响着水分的可利用程度及培养瓶内的相对湿度。

提高培养基中的琼脂浓度，可降低玻璃化的发生(表8)。但是，当琼脂浓度升高到大于1.0%时，培养基开始变硬，营养物质吸收困难，不利于愈伤组织的生长和分化。琼脂浓度在0.8%左右时，培养基的硬度适中，且玻璃化率不高(15.8%)，因此认为0.8%是较为适宜的琼脂浓度。另外发现，灭菌12 h或24 h后立即使用的培养基，较灭菌后放置3 d的培养基，组培苗玻璃化率明显升高，这可能与培养基内琼脂浓度不稳定致使环境湿度偏高有关。

表8 琼脂浓度对玻璃化的影响 Table 8 Effect of agar concentration on vitrification

1.2.4.3蔗糖浓度的影响
蔗糖作为培养基中常用的碳源，不仅能提供能量，还可以调节渗透压，是愈伤组织分化不可缺少的物质。增加蔗糖浓度可以降低玻璃化发生率(表9)，但蔗糖浓度的增加直接导致了生产成本的提高，而且高浓度的蔗糖也使污染率大大提高。因而，在实际操作中可根据需要调节适宜的蔗糖浓度，建议将蔗糖浓度保持在3%~4%。

表9 蔗糖浓度对玻璃化的影响 Table 9 Effect of sugar concentration on vitrificationn

1.2.4.4光照的影响
光照对试管苗的生长有极其重要的作用。光是影响叶绿素形成的主要因素，光照能促进光合作用的进行，合成更多的有机物，有利于细胞壁、细胞器的形态构建等作用。

随着光强的提高，玻璃苗的发生得到有效的抑制(表10)。光强提高到4 000 lx时，玻璃苗的发生率仅为9.5%。因此，在试管苗的分化培养时，应适当提高光强以降低玻璃苗的发生。

表10 光照对玻璃化的影响 Table 10 Effect of Light intensit on vitrification

1.2.4.5愈伤继代次数的影响
愈伤组织继代次数对试管苗的玻璃化有一定影响，但不是十分显著(表11)。当培养时间达200 d以上时，组培苗的玻璃化率明显升高，且芽分化生长缓慢；培养时间在50 d左右时，玻璃化率仅为3.5%，芽分化生长也较快，但出芽率较低。因而，兼顾出芽率和玻璃化率，本试验认为宜选取继代3次左右的愈伤组织用于分化出芽。

表11 继代次数对玻璃化的影响 Table 11 Effect of ages of callus cultured on vitrification

1.2.5防风试管苗玻璃化的逆转与培养条件优化
1.2.5.1逆转措施对不同程度玻璃化苗的影响
防风试管苗根据其玻璃化程度不同可分为3个等级。1级：玻璃化程度轻微，叶片深绿稍透明，形态生长较正常；2级：玻璃化程度较重，叶片黄绿透明，有卷曲，膨大现象，但能继续生长；3级：玻璃化程度很重，白绿透明，生长畸形，组织膨大变脆，呈水浸状。

选取程度不同的玻璃化苗分别进行试验观察，发现1级和2级玻璃化苗在转入改进条件下，可逐步培养恢复为正常苗。3级玻璃化苗无法逆转恢复，随着培养时间的延长，多慢慢枯死(表12)。

表12 不同玻璃化程度玻璃苗的逆转 Table 12 Reversion of different vitrification plantlets

图4 玻璃化苗的逆转 Figure 5 The reversion of vitrious plantlets

1.2.5.2培养条件的优化
有效抑制防风试管苗玻璃化的培养条件为:以嫩茎段为外植体，继代3次左右的愈伤组织诱导出芽，MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.8%做初分化培养基，芽继代增殖时，6-BA浓度1.0 mg/L和0.5 mg/L交替使用，新配置的培养基放置3 d以上再接种，培养光照3 000~4 000 lx。

2讨论
2.1培养基和外植体的影响
本试验对防风的再生体系进行了系统的研究，成功获得了生长健壮、根系发达的组培苗，为组培技术应用于工厂化生产提供了参考。试验发现，组培成功率受不同培养基和外植体的影响。MS培养基是防风愈伤组织诱导较为理想的培养基，而再生苗生根阶段则以1/2MS培养基为佳，说明随着生长阶段的进行，外植体需要不同的营养物质配比；以茎段和叶片为外植体诱导愈伤组织易受材料生长季节的影响，4月中旬到6月上旬是防风生长旺盛期，本试验取在此期间生长的幼嫩茎段为外植体，所得愈伤出愈时间短，数量多且质量好，后续分化能力强，试管苗质量较高。

2.2生长调节剂的影响
生长调节剂的种类和浓度配比是影响组培成功率的主要因子，试验中发现，只添加6-BA和KT，而不添加2,4-D的诱导培养基上，所有外植体均没有愈伤组织形成；而单独使用2,4-D时，除种子外，其它外植体上均有愈伤组织产生。这说明2,4-D是诱导愈伤组织形成的关键激素，这与前人报道相一致。有研究表明，2,4-D是通过改变细胞内源IAA代谢而起到诱导愈伤形成的作用(Sasaki et al., 1994)，大多数植物细胞必须在含有2,4-D的条件下，对内源生长素进行调节和平衡才能启动细胞分裂和胚性潜力的诱导(崔凯荣等, 2000)。

细胞分裂素和生长素的协同作用能激活有关基因和mRNA的表达(Crowell et al., 1990)，促进细胞的生长和分化，本实验中，2,4-D，6-BA和KT配合使用时，茎段出愈率高达96.7%。另外发
现，细胞分裂素的使用会产生累积现象，造成有些不定苗很难生成不定根，所以在诱导生根时应适当降低细胞分裂素水平，为生根提供条件。

2.3试管苗的玻璃化
本试验对防风组织培养获得的玻璃苗和正常苗进行过氧化物同工酶分析，二者谱带差异较大，防风玻璃苗的碱性区带增加，酸性区带明显较正常苗弱，这一结果与前人的报道基本一致，玻璃苗碱性过氧化物同工酶活性增强，酸性同工酶活性减弱(卜学贤和陈维纶, 1987; 周菊华等, 1993)。

试验发现，6-BA浓度过高极易导致防风试管苗的玻璃化。这可能是由6-BA本身的特性导致的，6-BA作为细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，因而玻璃化苗也表现出相应的茎节短，分枝多的特性。此外，过量外源激素会破坏植物体内保护酶系统的平衡(即SOD, CAT和POD三者的活性不协调) (王继方等, 1997)，这也导致了防风试管苗过氧化物同工酶电泳谱带的差异。

高蔗糖浓度可明显降低防风试管苗的玻璃化率，说明碳源供应状况对玻璃化的发生也有一定影响，可对其作用机制做进一步研究探讨。

3材料与方法
3.1材料
关防风外植体采自泰安市农科院中草药所。

3.2方法
3.2.1愈伤组织的诱导
取防风茎段，75%的酒精消毒30 s，再用0.1%升汞消毒5 min。切成约1 cm左右的小段，接种到不同激素组合的诱导培养基上，暗培养。设置0、0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L和2 mg/L 2,4-D，0、0.5 mg/L、1.0 mg/L和1.5 mg/L 6-BA，0、0.5 mg/L和1 mg/L KT。每个处理30块外植体，重复3次，外植体接种30 d后统计愈伤组织的诱导率。

诱导率(%)=出愈数(个)/接种数(个)×100%。

3.2.2愈伤组织的继代培养
选取茎段上生长旺盛的愈伤组织，将其转入附加不同浓度6-BA (0.5 mg/L、1.0 mg/L和1.5 mg/L)和NAA (0.5mg/L和1.0 mg/L)的MS培养基上进行继代，照光培养，每个处理30个愈伤，重复3次，30 d后统计愈伤增殖倍数。

增殖倍数=(愈伤组织继代培养后的鲜重－愈伤组织继代培养前的鲜重)/愈伤组织继代培养前的鲜重。

3.2.3不定芽的诱导
将继代增殖的愈伤组织转接于附加不同浓度NAA和6-BA的MS培养基上进行分化，照光培养。6-BA浓度设置0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L，NAA浓度设置0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L，采用正交设计。每个处理30个愈伤，重复3次，30 d后统计分化率。

分化率(%)=(出芽愈伤数/接种愈伤数)×100%。

3.2.4再生苗的生根培养
当丛生苗长至3.0~4.0 cm高时，将其切割成单苗转入附加NAA和6-BA的MS、1/2MS和1/3MS培养基上进行诱导生根。采用0.2 mg/L、0.5 mg/L和1.0 mg/L NAA，0、0.1 mg/L和0.2 mg/L 6-BA进行正交设计，照光培养。每处理接种30个单苗，重复3次，30 d后观察根的生长情况并统计生根率。

生根率(%)=(生根苗数/接种苗数)×100%。

3.1.5试管苗的驯化移栽
苗高4 cm以上，长出的新根系3 cm以上，且长出侧根，可进行移栽。移栽前先炼苗(张家菁等, 2012)。从培养瓶中取出发根的小苗，用自来水轻轻洗掉根部粘着的培养基，种植在0.1%多菌灵溶液消毒过的基质中，于培养箱中壮苗。移栽后逐渐降低培养箱的相对湿度，1周后移出培养箱。移栽基质设3个处理：河沙，田园土，腐质土:蛭石:河沙=1:1:1，。每个处理移栽60株，重复3次，30 d后统计移栽成活率。

以上培养基中均附加蔗糖3%，琼脂0.8%，pH 5.8~pH 6.0，光照强度2 000 lx，光暗各12 h，于25℃ (±1℃)条件下进行培养。

3.3防风试管苗玻璃化研究
3.3.1材料
生理生化指标的测定试验选取的是再生体系建立过程中培养条件相同，继代次数一致的玻璃苗和正常苗；玻璃苗的影响因子试验选取的是相同培养条件下的愈伤组织。

3.3.2试管苗生理生化指标的测定
3.2.2.1含水量测定
含水量测定：干重法。

3.3.2.2叶绿素测定
叶绿素测定：丙酮乙醇混合法，丙酮乙醇按1:1比例提取，具体参照(张宪政, 1986, 辽宁农业科学, (3): 26-28)。

3.3.2.4过氧化物酶同工酶电泳分析
同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法，具体参照(谢芝馨等, 2004)。

3.3.3不同因子对试管苗玻璃化的影响
3.2.3.1 6-BA浓度
设置4个处理，选择MS+NAA 0.5 mg/L+琼脂0.8%+蔗糖3%培养基，分别添加0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L 6-BA。

3.3.3.2琼脂浓度
设置4个处理，选择MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖3%培养基，分别添加0.6%、0.8%、1.0%和1.2%琼脂。

3.3.3.3蔗糖浓度
设置4个处理：选择MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+琼脂0.8%培养基，分别添加2%、3%、4%和5%蔗糖。

3.3.3.4光照强度
设置3个处理，分别为：0、2 000 lx和4 000 lx光照强度，光照时间为8 h，培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+3%蔗糖+0.8%琼脂。

3.3.3.5愈伤继代次数
设置4个处理，分别为：继代1次，3次，5次，7次的防风愈伤组织。

以上均采用每个处理接种30块愈伤组织，于同一出芽培养基上连续继代两次，统计玻璃化发生率。
玻璃化率(%)=(玻璃化芽数/总芽数)×100%。

3.3.3.6玻璃化苗的逆转
由玻璃化影响因子试验可知，玻璃化发生受多种因素的影响，其中增加琼脂和蔗糖浓度可以降低玻璃化发生率，但同时也降低了组培苗的生长速度，使生产成本提高，不利于大规模工厂化应用。

因而，在防风玻璃化苗的逆转中，选择的综合措施是：增加光照强度，降低细胞分裂素6-BA的浓度到0.7 mg/L，新配置的培养基放置3 d以上再接种。

作者贡献
马晓菲和张家菁是本研究的实验设计和实验研究的执行人；马晓菲完成数据分析，论文初稿的写作；于元杰是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
感谢山东中药技师学院李华斌老师的热情帮助。

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