UV-A/蓝光(320~500 nm)受体-隐花色素(Cryptochrome)在植物生长发育及光形态建成过程中起重要作用。拟南芥中的隐花色素作为UV-A/蓝光受体调节植物中UV-A/蓝光的光信号转导及花青素合成；与红光/远红光受体光敏色素(Phyptochrome)相互作用，参与调节各种光诱导反应，包括细胞伸长、植物根的生长发育、开花时间、昼夜节律时钟；与蓝光受体趋光素共同调节气孔开闭(Lin, 2000; Li and Yang, 2007)。

隐花色素是一种类光解酶的蓝光受体(Lin, 2000)。隐花色素蛋白与光裂解酶蛋白、黄素蛋白具有高度的同源性，却并不具有光裂解酶的DNA修复功能(Ahmad et al., 1998)，它具有DNA裂解酶所不具有的C末端区。研究发现迄今为止在植物中共存在三种隐花色素：CRY1、CRY2和CRY3。最初在拟南芥中发现的HY4突变体在依蓝光性的下胚轴伸长的抑制反应中丧失了对蓝光的敏感性(Koornneef et al., 1980)，这暗示着HY4基因编码的酶可能是与隐花色素有关的光敏感途径中必须的组分。在1993年由Ahmad和Cashmore从拟南芥的T-DNA插入突变体库筛选到HY4突变体，后来证实通过基因标签法分离到的HY4基因就是编码隐花色素的CRY1，它具有蓝光受体的黄素类型的结构(Ahmad and Cashmore, 1993; Lin et al., 1996a)。利用CRY1序列作为探针又从拟南芥的cDNA文库中筛选到了另一个隐花色素：CRY2 (Lin et al., 1996b; Lin et al., 1998)。隐花色素家族中的另一个成员CRY3于2003年被发现(Brudler et al., 2003; Kleine et al., 2003)，但其功能还不清楚。其他植物中的CRY1和CRY2相继被发现，但是CRY3在除拟南芥外的植物中还未见报道。

拟南芥中CRY1、CRY2具有不同的生理功能，但是在光形态建成和开花时间的光周期控制上却有着部分重叠的功能(Guo et al., 1998; Somers et al., 1998; Tóth et al., 2001)。cry1突变体在蓝光下不经历光形态建成而是显示了暗中发育的黄化的特征，而在白光和红光下却表现正常(Ahmad and Cashmore, 1993)。这说明CRY1是蓝光特异的受体，参与光形态建成反应。cry2突变体在蓝光下也表现出短的胚轴的表型，而且cry1cry2双突变体表现出比单突变体更严重的去黄化的表型(Jiao, 2003)，说明CRY2也参与光形态建成反应，进一步的研究表明，CRY2与开花时间有关(Lin, 2000; Li and Yang, 2007)。拟南芥CRY1在光下定位于细胞质中，而在黑暗中却积累于细胞核中，其C端的结构域含有核输入和输出信号；CRY2是核组成型蛋白，在光下和黑暗中均在细胞核中积累。CRY1和CRY2 mRNA的表达在不同光条件下不同的组织中没有明显的差别，在蛋白质水平上，拟南芥CRY1不明显受光的影响，而CRY2是受蓝光负调控的(Lin et al., 1998; Kleine et al., 2003)，CRY2蛋白存在依赖于蓝光的蛋白质磷酸化(Shalitin et al., 2002)。在蓝光信号调节的转录因子基因的表达中隐花色素起着最主要的作用，但是它不是唯一的光受体，蓝光下生长的cry1cry2双突变体表型说明很可能存在着其它类隐花色素的蓝光受体(Short and Briggs, 1994)。最近报道的新隐花色素成员CRY3为此提供了直接的证据(Brudler et al., 2003; Kleine et al., 2003)。

同时，作为植物光信号的转导因子之一，CRY1对色素物质合成途径中的各个关键基因的表达量也有一定的影响。通过测量花色素苷含量表明，cry1突变体花色素苷的水平低于野生型，而cry1过量表达植株花色素苷的含量则明显高于野生型，表明CRY1具有促进花色素苷积累的功能(Ahmad et al., 1995; Lin et al., 1995)，此外最新研究表明在拟南芥中CRY1与GPA1 (G-protein α subunit)相互作用调控色素苷的合成(Fox et al., 2012)。

在抑制基因表达的各种手段中，以近年来建立在反向遗传学基础之上的基因沉默技术RNA干涉(RNA interference, RNAi)发展迅速(Chuang and Meyerowitz, 2000; Wesley et al., 2001; Wojtjowiak et al., 2002)，并得到了广泛的应用，成为基因功能分析的重要方法(Stanislawska and Olszewskiw, 2005)。在植物基因功能组学研究中，RNAi技术多是以农杆菌介导的方式转化植物受体发挥作用(Wang and Metzlaff, 2005)。

本研究采用Gateway技术构建芜菁CRY1基因的RNAi表达载体，该研究对CRY1在津田芜菁光形态建成和光信号转导中的作用的研究提供了重要的基础。

1结果与分析
1.1克隆基因两侧引入attB重组位点
Gateway技术要求在目的基因的两端加入特定的接头序列attB，目的片段克隆连接attB接头后，与含有attP的donor载体连接产生Entry克隆。根据这个原则设计2对PCR引物，分别利用2对进行PCR反应，获得含有B序列的CRY1基因PCR产物(图1)。

图1 克隆基因CRY1两侧引入attB 位点 Figure 1 Adding attB site to the flanking boarders of CRY1gene by PCR

1.2 BP反应后阳性克隆的鉴定
BP克隆酶可以对pDONR221载体的特定位点和含有attB位点的PCR产物同时酶切，酶切下pDONR221载体的ccdB位点，CRY1基因的干涉片段取代载体上的ccdB位点。含有卡那霉素抗性的Entry克隆载体的BP反应产物转化大肠杆菌菌株TOP10感受态后，通过卡那霉素抗性进行初步筛选。此外pDONR221载体上还含有与M13引物可互补配对的序列，从而可以使用M13测序引物进行测序。结果表明，CRY1基因干涉片段已经成功插入pDONR221载体中，并且读码框正确，未发生移码现象(图2)。干涉区段序列在NCBI进行Blastn分析，结果如图3及表1所示。
 

图2 含B 序列接头的CRY1片段的核苷酸序列 Figure 2 CRY1gene sequence contained B adaptor sequence

图3 CRY1干涉区段Blastn结果 Figure 3 The Blastn result of CRY1 RNAi sequence

表1 CRY1干涉区段Blastn结果注释 Table 1 Explanation about the Blastn result of CRY1 RNAi sequence

1.3 LR反应后阳性克隆的鉴定
利用BP反应后得到的Entry克隆与植物双元表达载体pH7GWIWG2(I)进行LR反应，构建了由组成型启动子35S调控的CRY1基因的植物表达载体pH7GWIWG2(I)-CRY1 (图4)。将所构建的植物表达载体进行PCR检测，PCR得到370 bp左右的特异的DNA片段，与选取的干涉片段长度一致(图5)，说明构建成功。

图4 载体pH7GWIWG2(I)-CRY1的T-DNA结构图 Figure 4 The scheme of T-DNA vector of pH7GWIWG2(I)-CRY1

图5 重组表达载体的PCR检测 Figure 5 PCR detection of the recombinant expression vector

2讨论
Gateway克隆技术是Invitrogen公司开发的一项构建植物表达载体的新技术，它利用BP 克隆酶可以进行位点特异重组的特点，不需要使用任何限制性内切酶和连接酶，构建入门载体(Entry clone)。成功构建入门载体克隆后，就可以通过多次进行LR反应转移目标基因到不同的表达载体(destination vector, 目的载体)。与过去的传统的克隆基因技术相比，这种克隆快速方便，并且过程中一直保持目的基因的阅读框架，可以更加高效的使用每一种新的表达载体及系统。

RNA干涉现象自从被发现以来，科学家们利用RNA干涉技术已经在多种植物基因功能研究试验中成功的有效地阻断了特异基因的表达，RNA干涉技术的关键即选择目标基因进行干涉表达载体的构建(Wang and Metzlaff, 2005)。

利用Gateway克隆技术可以准确地、高效地、快速地构建RNA干涉表达载体，Gateway技术操作简便，反应条件易于控制。利用Gateway克隆技术构建的载体是一种二元载体，可以直接用于农杆菌介导的植物转化，这为利用RNA干涉技术研究植物特异基因以及未知基因功能提供的了坚实的基础。

研究表明拟南芥中隐花色素CRY1在光形态建成和花色素合成中具有重要调控作用(Li and Yang , 2007)，为研究其在津田芜菁中光信号转导中的作用，本论文利用Gateway技术成功的构建了双元RNAi表达载体pH7GWIWG2(I)-CRY1，这为通过遗传转化干涉掉津田芜菁CRY1基因，研究其功能及其介导的信号转导提供了基础。

3材料方法
3.1实验材料
本研究利用实验室保存的pBST-CRY1。试材来源于东北林业大学花卉生物工程研究所。Invitrogen公司Gateway克隆试剂盒包括BP Clonase^TMⅡ Enzyme Mix、LR Clonase^TM enzyme mix、Gateway pDONRTM 221 Vector；DNA Marker、T-vector、菌株TOP10购于大连Takara有限公司。

3.2 CRY1 attB引物序列的设计
根据实验室已克隆到的津田芜菁CRY1基因与其他基因的同源性，选择特异的区域作为RNA干涉区段，使用primer 5软件设计引物，根据Gateway克隆技术的要求设计含有B序列的引物，用于通过PCR的方法在CRY1基因干涉片段连接B序列的接头。由于B序列比较长，所以采用二次PCR的方法各加入一段B序列到目的基因的两端。根据所选序列和Gateway克隆技术手册以及attB PCR引物设计要求设计引物(由上海生工合成)如下：

attB-CRY1-F：5′-AAAAAGCAGGCTTCGAAGACCAAGAGTCGTCTC-3′；

attB-CRY1-R：5′-AGAAAGCTGGGTCAACTATTTCATGGTGGTTC-3′；

attB-adapter-F：5′- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3′；

attB-adapter-R：5′- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3′；

3.3植物RNAi表达载体的构建
利用已知的目的片段为模板，利用设计加有部分attB接头序列的引物进行PCR，回收纯化目的片段。利用回收纯化的含有attB接头的CRY1基因的PCR产物与质粒pDONR221进行BP反应，BP反应后的产物转化大肠杆菌感受态TOP10，37℃培养过夜。从过夜培养后的平板上挑取生长的单菌落进行PCR鉴定及测序鉴定。利用鉴定得到的阳性菌提取纯化得到的质粒与干涉表达载体pH7GWIWG2(I)进行LR反应，LR反应后的产物转化大肠杆菌感受态TOP10，37℃过夜培养，从平板上挑取单菌落进行PCR的鉴定，详细的方法及步骤参考佟友丽等(2007)的文章。

作者贡献
孙梅、马光和刘明雪是本研究的实验设计和实验研究的执行人；孙梅参与实验设计，试验结果分析；周波完成数据分析；李玉花和周波是项目的构思者；李玉花是项目的负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金项目(30730078)资助。

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