图位克隆技术在玉米基因分离中的应用  

吕洪坤 , 郑军
中国农业科学院作物科学研究所, 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京, 100081
作者    通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2013 年, 第 11 卷, 第 24 篇   doi: 10.3969/mpb.011.000460
收稿日期: 2012年11月15日    接受日期: 2012年12月28日    发表日期: 2013年01月18日
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摘要

图位克隆技术属于正向遗传学范畴,它以突变表型在遗传群体中的分离为出发点,寻找导致突变的遗传基础。本文简要介绍了图位克隆技术的遗传定位原理以及在玉米基因分离中的关键技术环节,并分析了图位克隆技术在玉米中应用可能遇到的问题以及可采取的解决措施。

关键词
玉米;图位克隆;基因克隆;分子标记

近年来,图位克隆技术在模式植物拟南芥以及重要农作物水稻中得到了广泛的应用,分离了一大批在农艺生产上有重要应用价值的基因(Bryan et al., 2000; Li et al., 2003; She et al., 2010; Tanabe et al., 2005),但在玉米方面的应用却相对较少。随着玉米基因组测序的完成(Schnable et al., 2009),大量分子标记的公布以及DNA多态性检测技术的不断改进,大大简化了玉米图位克隆的技术流程,降低了工作成本,使玉米基因的图位克隆变得更加简便、快捷,为图位克隆技术在玉米中的应用开辟了广阔的前景。

1图位克隆技术的遗传定位原理
图位克隆技术最早由剑桥大学的Alan Coulson提出(Coulson et al., 1986),该技术以突变表型为切入点,根据功能基因在基因组中有相对稳定的基因座位,利用遗传标记对目标基因进行初定位的基础上,再通过染色体步移(Tanksley et al., 1995)进行精细定位并克隆候选基因,最后通过遗传转化等实验对候选基因进行功能验证。

以玉米BC1F1群体定位为例,其遗传定位原理如图1所示:假定突变表型是由基因A的隐性突变造成的:A→a,在基因A/a的两侧分别有两个遗传标记M/m和N/n,选择与突变体表型有明显差异的正常玉米自交系与突变体进行杂交,假定这一自交系在M和N两标记上与突变体之间存在多态性(图1A)。正常自交系与突变体杂交得到F1植株(图1B),F1植株在配子形成过程中,若标记M/m与基因A/a之间发生了交换(图1C),则产生四种配子(图1D)。用突变体植株对F1植株进行回交,在得到的BC1F1群体中,具有突变体表型(前两种基因型)和正常表型(后两种基因型)的植株各占一半(图1E)。在具有突变体表型的植株中,第二种基因型可用于基因的定位(图1E)。选取具有突变体表型的BC1F1单株,用标记M/m对其基因型进行检测,如果基因型显示正常自交系的基因型(M),说明该单株在标记M/m与基因A/a之间发生了交换,如果标记M/m与基因A/a之间距离越远,则发生交换的概率越高,能检测到的交换单株数越多,反之越少。随着标记距离基因A/a的距离越近,能检测到的交换单株数越少,如果标记位于基因序列上,则会发生共分离,检测不到交换单株的存在,根据交换单株逐渐减少的趋势即可逐步的逼近候选基因。同样,标记N/n可用于检测基因另一侧的交换情况。如果基因两侧有足够大密度的遗传标记以及足够多的具有突变体表型的单株,就可将基因精确定位在一定的区间内。然后,可通过分析该区间内的基因组序列而克隆候选基因。

 
图1 图位克隆的遗传定位原理示意图
Figure 1 The principle of map-based cloning

2图位克隆的关键技术环节
图位克隆技术在植物中的应用最先始于模式植物拟南芥(Jander et al., 2002; Lukowitz et al., 2000),后来逐渐广泛应用于其他植物以及农作物(Fang et al., 2012; Makarevitch et al., 2012; Su et al., 2012),其关键技术环节包括:作图群体的构建,多态性遗传标记的筛选、开发与利用,目的基因的初定位,目的基因的精细定位,候选基因的获得以及目的基因的功能验证等。

2.1作图群体的构建
构建理想的作图群体是筛选与目的基因紧密连锁分子标记的关键,也是图位克隆工作能否顺利进行的基础。

玉米的图位克隆可用F2群体、BC1F1群体、重组自交系群体等。以常用的F2群体构建为例,将突变体与表型有差异的另一自交系杂交得到F1代种子。为了避免遗传背景中存在其他修饰因子而影响定位过程,可同时将突变体与几个自交系进行杂交,构建不同的作图群体备用。为了避免细胞质遗传的影响,还可将突变体分别作为父母本与正常自交系进行杂交。F1代种子播种出苗后可进行基因型和表型的鉴定,确认植株是杂合的基因型,同时判定突变的显隐性。F1植株自交得到F2代种子。据报道,4 000个F2单株可完成基因的精细定位,,其中200个左右单株可用于初定位,剩余的单株用于进一步精细定位(Candela et al., 2008; Woodward et al., 2010)。但根据本实验室的经验,精细定位所用的群体数目往往大大超出上述报道。另外,如果目的基因位于着丝粒附近,同源染色体间的交换率会明显降低,因此会需要更大的群体,为了避免再次扩大群体而花费更多的时间,最好一次性将群体构建到足够大。对于一些突变体和正常自交系差异不是很明显的表型,还需保留交换单株种子以便在后代植株中进行进一步表型鉴定。

构建F2群体时,正常自交系的选择除了表型与突变体之间要有差异外,更重要的是要事先鉴定与突变体间的多态性差异。如果多态性差异过大,可能在遗传标记处会存在碱基的差异,从而导致在突变体和自交系间的扩增能力存在差异;如果多态性过小,则可用的遗传标记数会很少,而且在新标记的开发上也会存在很大困难。在保证两材料间表型有可辨差异以及有足够多态性标记存在的情况下,正常自交系的选择可优先选择已经完成测序的B73自交系,因为这会给标记的开发和利用带来很大方便。

2.2多态性遗传标记的筛选、开发与利用
多态性遗传标记的筛选、开发与利用是顺利完成基因图位克隆的另一关键技术环节。在MaizeGDB数据库中(http://www.maizegdb.org/),已经公布了2019对SSR (Simple sequence repeats)标记,平均每条染色体多达200对,可方便的筛选出突变体与正常自交系之间存在多态性的标记,用于完成目的基因的初定位以及早期精细定位。

在精细定位过程后期,需要自行开发突变体与正常自交系之间的多态性标记。鉴于SSR标记操作简单且易于检测,可优先考虑开发SSR标记。例如,以B73基因组序列为参考序列,用SSRHunter软件搜索SSR位点(李强和万建民, 2005),软件会给出重复元件、重复次数以及位点上下游各150 bp的序列。在位点两侧序列上设计引物,扩增大约150~250 bp的PCR产物,检测该产物在突变体和正常自交系之间是否有多态性差异,如果存在差异,可进一步用于精细定位。

在定位区间较小且没有可用的SSR位点情况下,需考虑开发SNP (Single nucleotide polymorphism)标记。同样以B73基因组序列为参考,在定位区间内设计引物扩增大约1 kb长度的片段,通过对突变体和正常自交系分别进行测序,寻找两者之间的SNP位点,如果存在SNP位点,则进一步开发基于SNP位点的遗传标记(Lukowitz et al., 2000)。首先考虑的是费用相对较低且易于检测的基于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳的多态性检测技术,如果SNP在限制性酶切位点上,可开发酶切扩增多态性序列标记 (cleaved  amplified polymorphic sequences, CAPS) (Konieczny and Ausubel, 1993)。PCR扩增含有酶切位点的基因组序列,PCR产物用限制性内切酶进行酶切,电泳检测酶切产物,通过片段大小判断基因型(图2A)。如果SNP不在限制性酶切位点上,则可在扩增引物上设计酶切位点,用衍生酶切扩增多态性序列标记(derived cleaved amplified polymorphic sequences, dCAPS) (Michaels and Amasino, 1998)对基因型进行检测 (图2B)。这两种方法的不足之处是都需要用到价格较高的限制性内切酶,且酶切需要较长的时间,酶切不完全还可能影响到检测结果。

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图2 基于SNP位点的CAPS和dCAPS标记开发原理(Lukowitz et al., 2000)
Figure 2 The exploit principle of CAPS and dCAPS markers which are based on SNP (Lukowitz et al., 2000) 

单核苷酸扩增多态性(single-nucleotide amplified polymorphisms, SNAP) 也可以检测等位基因间的SNP差异(Drenkard et al., 2000),其方法是设计两条3′末端针对两个等位基因的特异性引物,并在两条特异性引物3′末端三个碱基范围内再分别引入一个错配碱基,进一步提高引物的特异性以便更好的对两个等位基因进行特异性扩增,引物错配碱基的引入可用SNAPER软件进行预测(http://patho.mgh.harvard.edu/ausubelweb),然后再设计两条反向引物,用两对引物对等位基因进行扩增,通过凝胶电泳检测扩增条带的显隐性即可判定材料的基因型(图3)。

 
图3 SNAP标记开发原理(Drenkard et al., 2000)
Figure 3 The exploit principle of SNAP (Drenkard et al., 2000)

随着测序技术的不断成熟和成本的不断降低,在SNP位点两侧设计引物,以基因组DNA为模板进行PCR扩增,对PCR产物进行直接测序,根据测序的峰图也可判定单株的基因型,该方法不但操作简单,可节约时间,而且数据可靠。

另外还有高通量的Taq-MAN PCR 技术(Livak, 1999),适合分组分析的DHPLC (Denaturing high-performance liquid chromatography) 技术(Spiegelman et al., 2000)等,但仪器和试剂费用都相对较高,对一般实验室而言并不能作为一项常规技术来用。

标记的开发利用是图位克隆过程中最繁琐耗时的一步,选择正确的方法能快速有效地实现基因的定位,不同的实验室要根据自己的人力,物力和财力选择适合本实验室的方法,在顺利完成基因克隆的同时使资源得到最有效地利用。

 
图4 通过测序峰图判定基因型示意图
Figure 4 Schematic representation of distinguishing the genotype through sequencing

2.3目的基因的初定位
以隐性突变性状为例,从定位群体中取大约200株左右的隐性纯合突变体植株提取基因组DNA,用于目的基因的初定位。利用MaizeGDB数据库中具有多态性的大约100对SSR标记(平均每条染色体上等距离选取10对左右)检测200个单株DNA的基因型,根据标记与突变表型的连锁关系以及交换单株出现的概率即可实现目的基因的初定位。假设,初定位的结果将目的基因定位在某条染色体的M11与M17标记之间(图5A; 图5B)。

 
图5 图位克隆过程示意图
Figure 5 Schematic representation of the map-based cloning process

2.4目的基因的精细定位
精细定位的目的是进一步缩小目的基因所在区间的距离,理想状态下,区间两侧仍存在少数交换单株,以更加明确目的基因所在的位置。

初定位过程中检测到的交换单株可进一步用来精细定位,从已公布SSR分子标记中,在基因初定位范围内筛选所有存在多态性的SSR标记,并用这些标记检测交换单株的基因型,进一步缩小目的基因所在的区间,直到区间两侧标记各能检测到2~3个交换单株时,确定为区间的左右边界标记,用来进行进一步定位工作(图5C)。

根据初定位时交换单株出现的概率以及初定区间左右边界之间的距离,粗略估计需要进一步扩大的群体数目。提取所有突变体的DNA,用左右边界标记来检测这些单株的基因型,寻找全部交换单株。用区间内全部具有多态性的标记检测这些交换单株的基因型,同时利用自己开发的SSR和SNP标记,寻找与目的基因紧密连锁的分子标记,尽量缩小目的基因所在的区间,完成目的基因的精细定位(图5D)。理想状态下,能找到与目的基因紧密连锁的分子标记,且左右边界上仍然有几个交换单株存在,这样更能确定目的基因的位置。

2.5候选基因的获得
一旦将基因定位在几个BAC (大约500 kb)或更小的范围内,可通过软件(例如: softberry软件, http://linux1.softberry.com/berry.phtml)分析这个范围内可能存在的候选基因(图5E)。以突变体和突变背景的基因组DNA为模板分片段扩增这些基因,对其PCR产物分别进行测序,并进行比对分析突变体和背景材料之间的DNA差异,寻找突变性状发生的DNA序列基础,从而确定候选基因。

2.6目的基因的功能验证
对于隐性突变而言,扩增突变背景材料基因的基因组序列或cDNA序列,构建植物表达载体,转化突变体植株,如果突变体能恢复到背景材料状态,证明突变表型是由该基因突变造成的,即可确定该基因就是造成突变的目的基因。对于显性突变而言,需扩增突变后基因的基因组序列或cDNA序列,转化正常植株,检测能否导致突变体表型来确证目的基因的功能。

对于一些互补实验难以进行的突变体,还需要对正常基因的表达进行干扰或敲除,检测目的基因在不能正常表达的情况下是否会出现突变体表型来进一步验证基因的功能。另外,寻找不同的等位基因突变体也可进行功能的验证,即如果同一基因的不同位点发生突变后能够导致相类似的表型,也可证明突变表型确是由该基因突变所造成的。

3提高图位克隆效率的可行方法
上面阐述的是图位克隆的一般过程,根据具体情况对该过程加以改进,则能更加快速有效地实现目的基因的克隆。

定位工作的目的是缩小突变位点所在的区间,一旦区间被确定,就可以结合相关信息寻找区间内发生突变的具体基因,理论上区间越小,越容易找到突变基因。在玉米基因组中,平均1%的重组率约为285 kb的物理距离(Schnable et al., 2009),但遗传距离和物理距离间的比例会因染色体上的具体位置和不同的作图群体有很大的变化。因此在构建作图群体时,可一次性将群体构建到足够大的数目(不少于40 000个F2单株或20 000个BC1F1单株),避免再次扩大群体而耗费额外的时间。

通常情况下,当基因所在区间被初步确定时,已知基因的注释信息往往有助于为候选基因的选择提供可靠的参考。查看该区间内具有注释的基因是否能够与突变表型相联系,从而推测可能的候选基因,并通过对突变体和突变背景候选基因的基因组序列分别进行测序来进一步确定突变位点,这就避免了精细定位后期标记开发的繁琐过程,并且能够尽早的发现克隆基因是否已经被研究过,有效地避免重复性实验造成资源的浪费。

分离群体分组分析法(bulked segregant analysis, BSA)是图位克隆中非常有效实用的方法(Michelmore et al., 1991),该方法将材料的DNA作为一个混合样品来提取、检测,而不是单个的来进行操作,这就大大减少了DNA提取的数量、PCR反应的数量和凝胶检测的样品数量,从而大大降低了工作量,缩短了实验周期。精细定位时,当标记距离候选基因很近时,交换单株出现的概率会大大降低,这时可以将五个左右的单株混合作为一个样品来提取DNA进行检测,如果存在交换,再对这个混合样的每个单株分别进行取样检测,找到具体的交换单株,用于后续定位,同样能减少工作量。

4图位克隆中可能遇到的问题及解决措施
表观突变是指基因的DNA序列并没有发生变化,但是基因的表达和功能却发生了可遗传的改变(Wolffe and Matzke, 1999),因此成为图位克隆过程中最难以克服的困难。虽然这种突变可以遗传,但是不稳定,受环境影响较大,有些情况下还会恢复到正常状态。比如由碱基的甲基化造成的基因转录表达的改变,虽然基因的DNA序列并没有发生变化,但是却有突变表型存在,用正常的基因序列进行互补能够使其恢复正常状态。

图位克隆过程中最可能遇到的另一问题是性状是由多个基因位点控制的,而不是有单个位点控制的,像一些自然发生的变异,如抗病、开花时间、籽粒大小、种子休眠、生物节律、次生代谢等性状(Lukowitz et al., 2000)。在精细定位过程中,一个位点的定位可能受到其他位点的影响,这种情况下就需要通过连续回交的方法将其他几个位点都替换掉,只留下其中一个位点进行定位、克隆。

物理距离和遗传距离之间的比例会受到染色体位置的影响。比如在染色体的着丝粒附近,染色体的交换重组会受到严重抑制,图位克隆过程会变得相当困难。在玉米基因组中,平均1%的重组率约为285 kb的物理距离,但是在着丝粒附近,交换率会大大降低(Schnable et al., 2009)。不过最近对着丝粒附近的序列分析表明,这些序列大部分都是重复序列,正常表达的基因数量很少(Schnable et al., 2009)。因此,图位克隆技术还是适应基因组中大多数基因的。

玉米的基因组序列中含有大量的重复序列,只有20%的序列是低拷贝序列(Gore et al., 2009),这为标记的开发带来了很大的困难。在开发标记时,必须在整个基因组序列上进行比对,序列特异后再用来进行后续定位,否则会出现非特异性扩增,必然会影响定位的可靠性,甚至干扰定位的结果。

5展望
在最近几年里,分子生物学领域开发了荧光定量PCR仪、第二代测序仪等一系列功能强大的实验仪器设备,Maize GDB (www.maizegdb.org/)、Maize Sequence(www.maizesequence.org/index.html)等公共数据库中公布了大量的玉米相关信息资源供研究者免费使用,充分利用这些资源,玉米的图位克隆技术会变得更加简单、直接、且具有可靠的预见性。

玉米不同自交系基因组的重测序、转录组的大量测序、不同自交系间SNP位点的公布以及对基因组结构特点认识的逐渐深入,将会解决目前图位克隆中遇到的技术难题,进一步提高玉米图位克隆的成功率。

玉米是重要的粮食作物,也是分子生物学研究的模式植物,且属于异花授粉植物,群体构建较易进行,表型观测显而易见。因此在不久的将来,图位克隆技术必将在玉米中得到更加广泛的应用。

作者贡献
吕洪坤负责完成相关资料的收集与整理工作;并完成论文初稿的写作。郑军负责文章的设计,指导写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家“863计划”课题(2012AA10A306)资助。感谢中国农科院作物科学研究所王国英教授的支持和建议。

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