稻瘟病是由子囊真菌(Pyricularia grisea Sacc.)引起的最具毁灭性的水稻病害之一，已在85个国家发现此病害(鄂志国等, 2008)。据报道，全球每年因稻瘟病造成的水稻产量损失约占水稻总产量的10%~15%，经济损失达数十亿美元(郑钊等, 2009)。目前，稻瘟病的防治主要通过农药和选育抗性品种。农药防治通常成本高、且污染环境，因此，发掘水稻自身的抗性基因资源，培育持久高抗品种，是最经济有效的病害控制措施(刘占领等, 2007, 作物杂志, 3: 16-19)。Pi-km基因是迄今为止已报道的77个稻瘟病抗性主效基因之一，定位于水稻的11号染色体上(国家水稻数据中心, 2012, http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)。

前人研究表明，Pi-km是稻瘟病抗性位点Pik上的一个主效抗病等位基因，Pik、Pi-kh、Pi-kp和Pi-ks与Pi-km是等位基因(Stefano and Yulin, 2010; Ashikawa et al., 2008)。抗病基因Pi-km对病菌具有较宽的抗谱，在水稻抗病育种中有较大的利用价值(Li et al., 2007)。但是，目前对陕西省水稻种质资源中抗稻瘟病基因Pi-km的研究还未见报道。

本研究利用与抗稻瘟病基因Pi-km紧密连锁的SNP标记设计的一组编号为K4731的寡核苷酸引物进行Pi-km基因位点的检测(Hayashi, 2006; Koide et al., 2009)，以期为水稻稻瘟病抗性品种育种提供参考。

1结果与分析
同一材料的抗性引物(R)与感性引物(S)经PCR扩增后的产物相邻点样，试验结果可能出现的情况如图1所示(左泳道为R, 右泳道为S)。
 

图1 抗性及感性引物的PCR产物的电泳结果示意图 Figure 1 Electrophoresis Schemes of PCR products by Resistant and susceptible Primers

1.1对照材料及部分供试水稻材料抗稻瘟病基因Pi-km的检测
以稻瘟病抗性水稻品种Tsuyuake及稻瘟病感性水稻品种93-11为对照，对部分供试水稻材料的Pi-km基因检测结果(图2)。结果显示，稻瘟病抗性基因纯合体仅在R道上扩增出171 bp左右的阳性特征条带；而感性基因纯合体仅在S道上扩增出171 bp左右的阴性特征条带；抗性基因杂合体同时在R、S道上扩增出171 bp左右特征条带。

图2 部分供试水稻品种抗稻瘟病基因Pi-km的PCR检测 Figure 2 Detecting results of Pi-km gene with PCR

1.2 2012年长江上游国家水稻区域试验材料Pi-km基因检测
2012年长江上游国家水稻区域试验材料共有62份，检测到28份材料为抗性基因纯合体，22份材料为抗性基因杂合体，8份材料为感性基因纯合体，4份材料未扩增出条带(表1)。

表1 国家水稻区域试验材料Pi-km基因检测 Table 1 Detecting results of Pi-km genes of samples on national rice regional test in the upper Yangtze river-2012

1.3陕西省水稻原始材料圃材料Pi-km基因检测
陕西省水稻研究所提供原始材料圃材料共244份，检测到100份材料为抗性基因纯合体，42份材料为抗性基因杂合体，95份材料为感性基因纯合体，7份材料未扩增出条带(表2)。

表2 陕西省水稻原始材料圃材料Pi-km基因检测 Table 2 Detecting results of Pi-km genes of original material region in Shaanxi Province

2讨论
目前，Pi-km基因在陕西省水稻种质资源中的分布状况还未见报道，本研究通过对稻瘟病抗性基因Pi-km检测发现，2012年306份水稻材料中有192份材料含抗性基因(其中128份为抗性基因纯合体，64份为抗性基因杂合体)，占实验材料的62.75%，感性基因纯合体占实验材料的33.66%，其中，2012年62份长江上游国家水稻区域试验材料，检测到28份材料为抗性基因纯合体，22份材料为抗性基因杂合体，含抗性基因的材料占81%。而244份原始材料圃材料中含抗性基因Pi-km的材料只占58%。没有扩增出条带的材料，可能是因为发生了等位变异，无法与引物互补配对，导致DNA扩增受阻。

由此可见，国家水稻区试中含抗性基因Pi-km的材料明显比陕西省水稻原始材料圃占较大比例，建议今后在稻瘟病抗性育种中加大对Pi-km基因材料的利用，同时，针对稻瘟病抗性涉及多个抗性基因的特点，增加抗源的多样性，增大育成持久稻瘟病抗性的机会。本实验仅对Pi-km基因存在状况进行检测，其他主效抗性基因是否存在还有待进一步研究。同时应结合材料的抗性表型选择试验，最终确定材料的抗稻瘟病性，用于抗稻瘟病遗传育种实践。

3材料和方法
3.1实验材料
2012年长江上游国家水稻区域试验材料62份和陕西省水稻研究所原始材料圃材料244份，由汉中市种子站和陕西省水稻研究所提供。阳性对照材料Tsuyuake和阴性对照材料93-11由国家水稻种质资源中期库提供。

3.2引物设计
本实验利用Hayashi等人设计的编号为K4731的引物进行等位基因特异性扩增检测Pi-km基因，K4731与Pi-km基因共分离。设计引物时将突变碱基落在突变引物的3′端，根据Taq酶缺乏3′→5′外切酶活性这一特点，3′末端错配碱基的引物，其延伸速度要低于正常末端碱基配对的引物的延伸速度，因此特异长度的扩增条带就不会出现，从而表明模板DNA与引物3′末端没有相应的突变。反之，则表明模板DNA上存在与引物3′末端相应的突变碱基。3′末端的碱基可以设计成与抗性基因序列完全互补而与感性基因序列不互补，也可以设计成与感性基因序列互补而与抗性不互补。为了增加扩增的特异性，K4731在感性正向引物的3′端第三位上引入了一个错配(G→T)。

抗性引物为5´-GCAGATGCATCAGCCAGTGAGTT-3´/5´-GTGCAGGACCGGCACGCAG-3´；感性引物为5´-GCAGATGCATCAGCCAGTGAGTG-3´/5´-GTGCAGGACCGGCACGCAG-3´。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

3.3基因组DNA提取及检测
用SDS法提取水稻基因组DNA。然后，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测水稻基因组DNA。

3.4 PCR扩增反应及凝胶电泳
PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmol/L的抗性/感性引物各1 μＬ，基因组DNA 1 μＬ，ddH_２O 12 μＬ，反应总体积30 μＬ。

PCR反应程序为：94.0℃预变性5 min，94.0℃变性50 s，50.0℃退火50 s，72.0℃延伸1 min，35个循环，最后72.0℃延伸10 min，4.0℃保存。之后，用1%的琼脂糖凝胶检测PCR结果。

作者贡献
张羽是本研究设计和实验研究的执行人；崔明珠和张晓娟完成论文初稿的写作和论文的修改；冯志峰是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究受到陕西省教育厅专项科研项目(12JK0815)和陕西省科技厅农业科技创新项目(NKC01-01)共同资助。感谢国家水稻种质资源中期库提供实验的部分材料。

参考文献
Ashikawa I., Hayashi N., Yamane H., Kanamori H., Wu J.Z., Matsumoto T., Ono K., and Yano M., 2008, Two adjacent nucleotide-binding site-leucine-rich repeat class genes are required to confer pikm-specific rice blast resistance, Genetics, 180: 2267-2276

E Z.G., Zhang L.J., Jiao G.A., Cheng B.Y., and Wang L., 2008, Highlights in identification and application of resistance genes to rice blast, Zhongguo Shuidao Kexue (Chinese Journal of Rice Science), 22(5): 533-540 (鄂志国, 张丽靖, 焦桂爱, 程本义, 王磊, 2008, 稻瘟病抗性基因的鉴定及利用进展,中国水稻科学, 22(5): 533-540)
Hayashi K., Yoshida H., and Ashikawa I., 2006, Development of PCR-based allele-specific and InDel marker sets for nine rice blast resistance genes, Theor. Appl. Genet., 113(2): 251-260

Li L.Y., Wang L., Jing J.X., Li Z.Q., Lin F., Huang L.F., and Pan Q.H., 2007, The Pik^m gene, conferring stable resistance to isolates of Magnaporthe oryzae, was finely mapped in a crossover-cold region on rice chromosome 11, Molecular Breeding, 20(2): 179-188

Stefano C., and Yulin J., 2010, Sequence variation at the rice blast resistance gene Pi-km locus: implications for the development of allele specific markers, Plant Science, 178(6): 523-530

Koide Y., Kobayashi N., Xu D., and Fukuta Y., 2009, Resistance genes and selection DNA markers for blast disease in rice (Oryza sativa L.), JARQ, 43(4): 255-280
Zheng Z., Chen Y.Q., Zhang J.F., and Xie H.A., 2009, Mapping cloning of rice blast resistance genes and their application, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 7(2): 385-392 (郑钊, 陈由强, 张建福, 谢华安, 2009, 水稻稻瘟病抗性基因定位克隆及应用, 分子植物育种, 7(2): 385-392)