由霜霉病菌(Hyaloperonospora parasitica)引起的芸薹属霜霉病是一种世界性病害，在冷凉地区(例如中国的华北地区和法国的西北部)易形成露珠的气候条件下，该病菌会引起不同的十字花科作物霜霉病的爆发并流行。自从Persoon (1976)首次记录芸薹属霜霉病以来，人们对霜霉病菌从各个方面进行了研究。Gäumann (1923)研究了该病菌的寄主类型和病菌形态学特征，并且把芸薹属霜霉病菌分成52个种，这种分类结果被大多数卵菌分类学家所接受；Yerkes和Shaw (1959)研究认为寄主为芸苔属(Brassicaceae)的霜霉病菌应该归为同一个种，这也被植物病理学家普遍认可。Göker (2003)认为传统的病菌分类方法是按形态的、生理的和生态的方法来划分的，随着分子生物学的发展，分子数据库、基因标记和普通分类方法的综合应用有可能使得霜霉菌的分类更为科学。

在中国，徐家炳和张凤兰根据霜霉菌对7个鉴别寄主的致病性不同，将白菜霜霉病菌划分为7个生理型(徐家炳和张凤兰, 2006, 当代蔬菜, 12:16-18)。然而，在分子水平上对大白菜和甘蓝寄生霜霉病菌进化关系的研究还未见报道。本研究综合运用病菌的形态特征、致病性和rDNA-ITS序列分析对寄生在大白菜和甘蓝中的霜霉菌进行了研究，探讨了这两种霜霉病原菌的异同及其在系统发育过程中的关系。

1结果与分析
1.1病原菌形态观察
大白菜与甘蓝寄生霜霉菌的单个分生孢子均呈透明状，形状为椭圆形或近球形，两种霜霉菌的分生孢子大小都约为20 μm，孢囊梗都是多支，无色透明，基部无明显膨大，有细长的主干，上部锐角二叉分支，分支1~7次，多为3~5次，枝端尖细，无规则弯曲。二者在形态上没有明显的区别，均属于Hyaloperonospora属。

图1 显微镜下观察两种病菌的形态 Figure 1 Morphological characteristics of two downy mildew pathogens

1.2致病性比较
接种大白菜霜霉病菌7 d后调查病情，感病材料叶片背面有白色霉层，抗病材料出现过敏反应，耐病材料有少量霉层出现。用甘蓝霜霉病菌接种7 d后，大部分大白菜材料均有过敏反应，仅有一份大白菜材料的叶片背面有零星孢子出现(图2)。两种病原菌对大白菜的致病力表现出明显差异(表1)。方差分析表明，菌株间P=4.37E-09，小于0.01，表明这两种菌株间存在着明显的致病力差异，大白菜霜霉病菌对大白菜有很强的致病力，甘蓝霜霉病菌对大白菜具有较弱的致病性。综合表1和图2的结果来看，这两种病菌对大白菜的致病结果存在显著差异，二者属于不同的生理型。

图2 3份材料接种大白菜和甘蓝霜霉病菌7 d后的抗性表现 Figure 2 The resistance of 3 materials 7 d after inoculated with Chinese cabbage and cabbage downy mildew pathogens

表1 接种大白菜霜霉病菌和甘蓝霜霉病菌后病情调查结果 Table 1 The resistance of 19 Chinese cabbage materials inoculated with Chinese cabbage and cabbage downy mildew pathogens

1.3 rDNA-ITS序列分析
通过扩增大白菜和甘蓝的寄生霜霉菌rDNA-ITS区，经过克隆、测序，结果表明：两种病菌的ITS序列长度分别为962 bp和963 bp。把序列提交至GeneBank后，获取登录号分别为JF975613和JF975614。大白菜霜霉病菌的rDNA-ITS1全长219 bp，5.8S全长159 bp，rDNA-ITS2全长303 bp；甘蓝霜霉病菌的rDNA-ITS1全长218 bp，5.8S全长159 bp，rDNA-ITS2全长303 bp。二者序列的一致性很高，达99.95%，仅有4个变异位点。

从GenBank中下载部分十字花科蔬菜的寄生霜霉菌rDNA-ITS序列，进行同源性比对，结果表明，二者与来自韩国甘蓝上的霜霉病菌(EU137726)的序列一致性均达99.89 %。与EU137726相比，大白菜霜霉病(JF975613)在ITS2区域的第684位点发生了点突变，由碱基A→G单碱基转换；甘蓝病菌(JF975614)在ITS1区域的第7位点发生了缺失突变，C碱基缺失(图3)。在ITS1区域芸薹属霜霉病菌与萝卜属(EU049278)霜霉病菌相比存在29个碱基的插入，与白芥属(AY531403)和拟南芥属霜霉病菌(EU049236)差异较大。霜霉病菌的5.8S序列在不同属间的一致性非常高，芸薹属霜霉病菌与萝卜属霜霉病菌的5.8S序列只有1个碱基不同，与拟南芥属霜霉病菌(EU049236)有4个位点的变异。在ITS2区域，白芥属(AY531403)、萝卜属(EU049278)、拟南芥属(EU049236)寄生霜霉病菌与芸薹属霜霉病菌相比均有75个碱基缺失，变异位点也较多。

图3 霜霉病菌ITS区序列JF975613, JF975614, EU137726, AY531403, EU049278, EU049236同源性比对 Figure 3 ITS sequences homology identity of downy mildew pathogens between JF975613, JF975614, EU137726, AY531403, EU049278, EU049236

1.4进化树构建
经过对寄生于大白菜和甘蓝霜霉菌的rDNA-ITS序列进行BLASTN分析，选取并下载17个十字花科霜霉病菌的ITS序列(表2)，利用MEGA version 4.0软件构建系统发育树(图4)。结果显示：19个十字花科霜霉病病菌的ITS序列聚为4个分支，按寄主的分类被划分为芸薹属霜霉病菌、白芥属霜霉病菌、萝卜属霜霉病菌和拟南芥属霜霉病菌，相同属寄生霜霉菌的进化关系较近，以较高的支持率聚在同一分支。JF975613和JF975614与甘蓝和甘蓝型油菜上的霜霉病菌以100%的支持率聚在同一分支。

表2 制作进化树引用的序列 Table 2 Sequences used to make Parsimonious trees

图4 用MEGA4.0软件构建系统发育树 Figure 4 Parsimonious trees based on analysis of rDNA ITS sequences with MEGA4.0

2讨论
芸薹属霜霉病菌属鞭毛菌亚门、霜霉目、霜霉科、霜霉属真菌，专性寄生(柯桂兰, 2009)。从不同的寄主上分离出的菌株形态相似，但是寄主范围却差异很大，因此很难确定它们的进化关系。在病菌分类鉴定方面，病原菌的形态常常作为一种重要指标来鉴定病菌间亲缘关系。本研究通过观测病原菌的孢子和孢囊梗形态表明，大白菜和甘蓝的寄生霜霉菌具有较高的相似性，很难判定二者间的亲缘关系，尚需从其他方面做进一步的研究。

Satou (2000)研究表明，从结球甘蓝和花椰菜上分离的霜霉病菌孢子对甘蓝类栽培种有较强的致病性，但是不能侵染大白菜和日本小萝卜；从中国大白菜上分离的孢子对大多数大白菜栽培品种有致病力。本研究也取得了较为类似的结果，即大白菜和甘蓝的寄生霜霉菌对大白菜的致病力存在明显的不同，接种甘蓝霜霉病菌后大白菜表现出过敏反应，只是有极少数的叶片有零星孢子；而不同大白菜品种对大白菜霜霉病菌具有不同的抗性表现，二者应该属于不同的生理型，这也与赖传雅对芸薹属霜霉病菌生理型划分基本吻合(赖传雅, 2003, 科学出版社, pp.359-362)。

rDNA-ITS序列已被广泛应用于真菌的系统发育关系研究。陈永青等(2002)对22种拟茎点霉34个菌株进行了系统发育研究，王娜等(2007)对黄瓜霜霉病和白粉病病原菌的rDNA-ITS序列进行了研究。本研究表明使用rDNA-ITS方法对大白菜和甘蓝霜霉病菌的异同进行研究，结果表明：大白菜和甘蓝霜霉病菌的5.8S序列十分保守，ITS1序列比ITS2序列变异范围大，更适于进行系统进化分析，这与Cooke等(2000)对234个卵菌样本的ITS分析相一致。寄生在甘蓝和大白菜上的霜霉病菌与甘蓝型油菜霜霉病菌关系较近，聚类在一起，并且同属作物的寄生霜霉菌具有非常近的系统进化关系。

芸薹属霜霉病菌为活体专性寄生菌，必须在活体上转接、保存、分离，尚不能离体培养，所以该实验只采集了北京地区的甘蓝和大白菜霜霉病菌。Spring等(2006)认为地理位置对病菌变异有一定的影响。因此想要确定芸薹属霜霉病菌的进化关系，需要采集不同地理位置，不同寄主的病菌，做更深入的研究。

3材料与方法
3.1植物材料和接种物准备
选取19份大白菜材料用于霜霉菌的致病性测试，包括3份早熟春播材料、4份早熟夏播材料和12份秋播材料(4份早熟, 4份中熟和4份晚熟材料)，均来源于北京市农林科学院蔬菜中心白菜育种组。

大白菜霜霉病菌来自北京市农林科学院蔬菜中心，长期活体保存在易感材料“A8尖”上；甘蓝霜霉病菌由北京市农林科学院蔬菜中心耐寒类作物育种甘蓝育种组提供。

3.2致病性测试
把19份大白菜材料于26℃催芽24 h，然后播种在装有无菌土的穴盘内，放置日光温室，白天气温为(25±1)℃，夜晚为(16±1)℃，光周期为12 h。当幼苗长至2片真叶时，用毛笔从发病叶片上把病菌刷至无菌蒸馏水内，将孢子悬浮液用两层45 μm的平纹细布过滤，去除植物碎片及杂质，用血球计数板把孢子浓度调整为1×10⁵个孢子/mL。以清水为对照，用喷雾法接种，接种后用塑料薄膜密封保湿，用黑膜遮盖，温度控制到(16±5)℃，相对湿度为95%以上，24 h后去掉覆盖物，按照常规方法管理，7 d后再密闭保湿24 h，第二天观察病情，调查病情指数。试验设三次重复，随机区组排列。接病方法及病情调查参照程永安和柯桂兰(1995)的霜霉病分级标准：0级：无侵染症状；1级：接种叶上有稀疏的褐色斑点，不扩展；3级：叶片有较多的病斑，多数凹陷，叶背无霉层；5级：叶片病斑向四处扩展，叶背生少量霉层；7级：病斑扩展面积达叶片的1/2以上2/3以下，有较多霉层；9级：病斑扩展面积达叶片的2/3以上，有大量霉层。

以病情指数确定其抗、感类型，标准如下：高抗(HR)：0＜DI≤11.1；抗病(R)：11.1＜DI≤33.3；耐病(T)：33.4＜DI≤55.5；感病(S)：55.6＜DI≤77.7；高感(HS)：DI＞77.8。

3.3病菌形态学观察
将保存有白菜霜霉病菌和甘蓝霜霉病菌的植株用塑料薄膜覆盖，黑暗，湿度保持在95%以上，温度(16±1)℃，24 h，次日用毛笔将霜霉病菌刷至无菌蒸馏水中，用移液器吸20μL菌液，把菌液滴至载玻片上，在光学显微镜下观察病菌形态。

3.4病菌DNA提取及r DNA-ITS扩增
采用Riethmüller等(2002)改进的CTAB法提取病菌DNA，-20℃保存。用1.2%琼脂糖凝胶电泳和THERMO 100分光光度计检测DNA浓度和纯度。
应用真菌通用引物对r DNA-ITS扩增。

上游引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，下游引物ITS4：5’-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反应体系20 μL：上下游引物ITS1和ITS4各1.2 μL (100 μmol/L) (由上海生工公司合成)，模板DNA 2 ng，10×PCR Buffer(含Mg²⁺) 2 μL，2.5 mmol/L dNTP mix 1.8 μL，5 U/μL Taq酶0.2 μL (以上试剂购买于TaKaRa公司)，用双蒸水调反应液总体积至20 μL，在PCR扩增仪器(BIO-RAD)上进行反应。PCR扩增程序：预变性94℃ 3 min，变性94℃40 s，退火51℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，35个循环，最后72℃延伸8 min，8℃保存。PCR扩增产物利用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，使用上海生物工程技术服务有限公司的DNA凝胶回收试剂盒回收，操作步骤参照使用说明。采用北京全式金生物技术有限公司pEASY-T1 Simple cloning Vector连接，转化于感受态细胞Trans1-T1中，进行蓝白斑筛选，然后把菌液送至金唯智生物科技(北京)有限公司测序。

3.5序列同源性分析及进化树制作
将获得的两个菌株的rDNA-ITS序列提交核算数据库GenBank，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行BLAST。用DNAMAN软件进行序列比对，用分子进化软件MEGA version 4.0 (Tamura et al., 2007)分析二者的系统发育关系并构建进化树，采用邻位相连法(NJ，neighbor-joining)进行进化距离分析，运用Bootstrap对系统树进行检验，重复1 000次。

作者贡献
张胜菊和于栓仓是本研究的实验设计和实验研究的执行人，并完成论文初稿的写作；余阳俊、赵岫云和张德双参与实验设计；张胜菊和汪维红完成数据分析和试验结果分析；张凤兰是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改；全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金(31171959)、北京市科技项目(D111100001311002)、国家科技支撑计划(2010BAD02B01)和大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-A-11)资助。感谢北京市农林科学院蔬菜研究中心卢桂香老师在实验执行过程给予的大力支持。

参考文献
Chen Y.Q., Jiang Z.D. and Qi P.K., 2002, Application of rapd and its region sequence analyses on classification and identification of Phomopsis, Bubak, Junwu Xitong (Mycosystema), 21(1): 39-46 (陈永青,姜子德, 戚佩坤, 2002, RAPD分析与ITS序列分析在拟茎点霉分类鉴定上的应用, 菌物系统, 21(1): 39-46)

Cheng Y.A. and Ke G.L., 1995, Factors affecting evaluvtion of Chinese cabbage resistance to downy mildew, Xibei Nongye Xuebao (Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica), 4(4): 69-72 (程永安, 柯桂兰, 1995, 影响大白菜霜霉病抗性鉴定的因素, 西北农业学报, 4(4): 69-72)

Cooke D.E., Drenth A., Duncan J.M., Wagels G., and Brasier C.M., 2000, A molecular phylogeny of Phytophthora and related oomycetes, Fungal. Genet. Biol., 30(1): 17-32

Göker M., Voglmayr H., Riethmüller A., Weiß M., and Oberwinkler F., 2003, Taxonomic aspects of Peronosporaceae inferred from Bayesian molecular phylogenetics, Can. J. Bot., 81(7): 672-683

Gäumann E., ed., 1923, Beiträge zu einer Monographie der Gattung Peronospora Corda, Fretz, zurich, Schweiz, 5(4): 1-360

Ke G.L., ed., 2009, Chinese Cabbage Breeding, China Agriculture Press, China, Beijing, pp.162-163 (柯桂兰, 编著, 2009, 中国大白菜育种学, 中国农业出版社, 中国, 北京, pp.162-163)

Persoon C.H., 1796, Observationes mycologicae, Wolf Press, Leipzig, 1: 23-24

Riethmüller A., Voglmayr H., Göker M., Weiß M., and Oberwinkler F., 2002, Phylogenetic relationships of the downy mildews (Peronosporales) and related groups based on nuclear large subunit ribosomal DNA sequences, Mycologia, 94(5): 834-849

Satou M., 2000, Studies of physiological specialization of downy mildew of crucifers caused by peronospora parasitica, J. Gen. Plant Pathol., 66(3): 283

Spring O., Bachofer M., Thines M., Riethmüller A., Göker M., and Oberwinkler F., 2006, Intraspecific relationship of Plasmopara halstedii isolates differing in pathogenicity and geographic origin based on ITS sequence data, Eur. J. Plant Pathol., 114(3): 309-315

Tamura K., Dodley J., Nei M., and Kumar S., 2007, MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0, Mol. Biol. Evol., 24(8):196-1599

Wang N., Ma Y.J., Dai G.H., and Wang Z.Z., 2007, rDNA-ITS sequence analysis of cucumber downy mildew and cucumber powdery mildew's pathogen, Xibei Nonglin Keji Daxue Xuebao (Journal of Norhtwest A & F Unirersity (Nat. Sci. Ed.), 35(10): 155-158 (王娜, 马雅军, 代光辉, 王喆之, 2007, 黄瓜霜霉病和白粉病病原菌的rDNA-ITS序列分析, 西北农林科技大学学报(自然科学版), 35(10): 155-158)

Yerkes W.D., and Shaw C.G., 1959, Taxonomy of the peronospora species on cruci-ferae and chenopodiaceae, Phytopathology, 49(8): 499-507