WRKY转录因子蛋白质的N端都含有高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和C₂H₂或是C₂HC的锌指结构，该蛋白可以通过识别目标基因启动子上的特定序列来调节基因的表达，进而调控植物的许多重要的生命过程。因此，WRKY基因家族是植物中一个重要的超级基因家族(Yu et al., 2001; Wu et al., 2005)。

水稻是重要的粮食作物，在水稻全基因组测序完成后，水稻WRKY转录调控因子的功能研究随之逐渐开展，研究资料正不断地积累，目前已经发现它在水稻抗病、耐逆、衰老、糖代谢以及形态建成方面发挥重要作用(宋钰等, 2009)。但它在调节水稻淀粉累积或胚乳形成方面还缺乏相关的研究。

在同属禾谷类作物大麦中，前人发现了一个WRKY转录因子基因SUSIBA2，它的表达受植物组织中蔗糖含量的诱导，可在大麦的胚乳形成过程中调节淀粉合成相关酶基因(iso1和sbeⅡb)的表达水平，影响大麦谷粒中淀粉的累积状况(Sun et al., 2003; 2005)。这一功能揭示出WRKY转录因子也可参与作物碳水化合物同化作用的调控以及叶片与谷粒之间库源关系的调节，具有十分重要的意义。2008年，陈坚等率先报道于水稻的幼穗中克隆到一个cDNA全长为1 921 bp的WRKY基因，蛋白序列比对分析发现它与大麦的SUSIBA2的相似性高达81%，并能在稻穗发育过程中迅速表达。由于推测它可能具有与SUSIBA2基因的功能相似，命名其为SUSIRI (陈坚等, 2008)。

为进一步揭示SUSIRI基因在水稻基因表达调控所起的作用，通过构建由Ubiqutin启动子驱动的SUSIRI基因的过表达与RNA干扰载体并转化水稻，希望借助转基因手段对该基因进行了正向与反向两个方面的分析。本研究报道获得的转基因后代植株所呈现的分子及若干表型效应的分析。

1结果与分析
1.1水稻转录因子基因SUSIRI的过表达及RNA干扰转基因植株的基因组检测
对转基因水稻的不同世代，在用潮霉素筛选阳性植株的基础上，选取hpt以及SUSIRI基因引物进行PCR检测。通过PCR产物电泳，SUSIRI的过表达及RNA干扰的转基因水稻结果均能扩增出832 bp的hpt目的条带；用SUSIRI基因进行检测时，仅有过表达转基因水稻的基因组才能扩增出1 850 bp的SUSIRI目的条带，野生型对照与RNA干扰转基因植株均无此条带(图1)。可见虽然SUSIRI基因是水稻本身固有的内源基因，但在基因组中，它包含了5个内含子，如用设计的引物扩增基因组，扩增子长约为5 000 bp (陈坚等, 2008; 方结红等, 2010)，这是一般的PCR条件难以得到的。这就在hpt基因筛选出转基因植株的基础上，可用SUSIRI基因辨别出过表达的植株。

图1 转基因水稻基因组hpt与SUSIRI基因的PCR检测 Figure 1 PCR detection of hpt and SUSIRI gene in genome of transgenic rice

1.2水稻转录因子基因SUSIRI的时空表达检测
分别在40~50 d水稻的的苗期(图2A)与120 d以后抽穗灌浆期(图2B)，提取野生型水稻不同部位样品的RNA进行半定量RT-PCR检测，发现无论在水稻的营养生长还是生殖生长阶段，除水稻根部外，SUSIRI基因在水稻的营养器官叶片与茎中均有较高程度的表达，这两种器官都涉及到碳水化合物的制造、运输及储存。在水稻的生殖器官稻穗中，该基因在刚抽出的幼穗以及在扬花闭合后灌浆的早中期的穗中均保持活性；但随谷粒饱满，基因活性迅速下降，这一结果与先前用Northern杂交在稻穗中分析的结果相似(陈坚等, 2008)。

图2 以ACTIN基因为参照的SUSIRI基因在水稻苗期与穗期在不同部位中的表达状况 Figure 2 The expression of SUSIRI gene in different parts of rice during seedling and heading stages used ACTIN gene as control

1.3水稻转录因子基因SUSIRI过表达及RNA干扰转基因植株的基因表达检测
在对野生型水稻分析的基础上，分别在苗期以水稻叶片及在穗期以叶片和灌浆早期水稻的幼穗为样品提取RNA，对T₁代水稻植株的SUSIRI基因进行表达分析。图3的结果说明：无论在苗期(图3A)还是在穗期(图3B)，过表达转基因水稻的基因表达模式均与对照相似，而RNA干扰植株的SUSIRI基因表达明显减弱。

图3 以ACTIN基因为参照的SUSIRI基因在水稻的苗期与穗期于叶片和幼穗中的表达状况 Figure 3 The expression of SUSIRI gene in leaf and young panicle of rice during seedling and heading stages used ACTIN gene as control

1.4水稻转录因子基因SUSIRI的过表达及RNA干扰转基因植株的表型考察
预期SUSIRI与SUSIBA2功能相似，主要影响谷粒中淀粉的累积过程。我们重点对转基因植株的稻穗与谷粒性状进行了考察，考种结果总结在表1中。数据显示：与野生型植株相比，两种转基因植株的每穗粒数与结实率均下降，尤其是RNA干扰植株的穗粒数与结实率与野生型及过表达植株的差异均达到显著水平(P<0.05)。但在称量三者正常饱满谷粒的粒重后，未见稻株千粒重的差异(P>0.05)。田间观察发现：在苗期，三者水稻的表型基本一致。进入抽穗阶段，RNA干扰植株有个别不抽穗或抽穗能力下降，大多数RNA干扰植株抽穗还比较正常。主要变异出现在谷粒灌浆成熟阶段，基本上所有RNA干扰植株的稻穗均出现灌浆不足，谷粒不成熟的现象(典型的穗如图4中红色箭头所示仅有1颗谷粒饱满成熟)，不成熟的到后期皆为瘪谷。因此，在移植田间T₀代RNA干扰植株中，5株结实率为0；在收获种子的46株T₀代转基因植株中，22株的结实率在0.5%~29%之间。继代种植时，123株T₁代RNA干扰植株的单株结实率仅维持在2%~76%。与此相反，34株T₀与131株T₁代的SUSIRI过表达转基因植株抽穗灌浆状况与野生型类似，多数单株结实正常，结实率与野生型差别不大(结实率>60%)。然而，对前后总计165株过表达植株进行表型考察，发现各性状在总体上都不如野生型，也未能筛选出考种性状明显超过野生型对照的优秀单株。

表1 野生型与SUSIRI基因过表达及RNA干扰转基因稻株间表型性状比较 Table 1 The comparison of phenotypic traits among wild type, SUSIRI over-expressing and RNA interfering rice plants

图4 RNA干扰植株的结实表现 Figure 4 The seeding appearance of a typical RNAi transgenic plant

2讨论
方结红等(2010)也从水稻中获得全长为1 719 bp的SUSIBA2-like基因。通过选取eEF-1α为内参基因的半定量RT-PCR分析结果显示：SUSIBA2-like基因在根中不表达，在茎和叶中有表达，在胚乳中表达并在灌浆后12 d达到最高值。这一结果与本研究结果基本相同，并证实SUSIRI基因与SUSIBA2基因表达的模式有一定程度的不同：即在水稻进入生殖生长期，该基因不仅能够在灌浆稻穗的胚乳中表达，也能在茎和叶中同步表达；而SUSIBA2基因仅在大麦的胚乳中表达。此外，本研究还发现即使在营养生长的苗期阶段，该基因也有一定程度的表达。由此推测SUSIRI基因功能比SUSIBA2的更复杂。

本研究在克隆SUSIRI基础上，进一步利用转基因技术获得SUSIRI基因的过表达与RNA干扰的植株。对这些转基因植株进行分子与表型的效应分析发现：转入过表达SUSIRI基因的水稻与野生型的水稻在SUSIRI表达上的差异用半定量PCR难以辨别；但更重要的是在表型方面，尤其在稻穗和谷粒的表型上，SUSIRI的过表达并没有使遗传性状发生明显的改善。相反，一旦SUSIRI基因的表达受到干扰，不仅RNA分子水平的表现十分明显，表型上也导致水稻的结实能力大幅下降。研究最终说明该基因的干扰会影响水稻谷粒的形成。
因此，我们认为SUSIRI基因是水稻调节源流库关系以及最终影响水稻库建成一个起关键作用的转录因子。揭示它所针对的靶标基因，进一步明确其功能已迫在眉睫。

3材料与方法 
3.1水稻材料和有关试剂
粳稻品种“中花11”由北京未名凯拓生物技术公司提供。RNA提取试剂购自Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶、内切酶、逆转录试剂盒为Takara公司产品。所有引物合成和基因测序由上海生工生物工程公司完成。

3.2转基因载体与水稻转化
以克隆的SUSIRI基因构建由Ubqutin启动子驱动的SUSIRI的过表达载体与RNA干扰的表达载体，RNAi载体的构建过程已报道(陈坚等, 2009)。载体结构如图5所示。采用农杆菌介导法，将基因表达载体导入水稻材料的幼胚愈伤组织中，所用根癌农杆菌菌株为AGL0。愈伤组织经潮霉素(50 mg/L)抗性筛选，再生成植株。

图5 SUSIRI基因的过表达载体与 RNA干扰载体的结构图 Figure 5 Structure of over-expressing and RNAi vector for SUSIRI gene

3.3转基因材料的PCR检测
以hpt基因检测所有转基因材料，正向引物为5'-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'，反向引物为5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'；以SUSIRI基因的全长ORF为对象检测过表达的转基因材料。正向引物SUWRI 160s：5'-GGCGAGGTACAAGGCGATGT-3'；反向引物 SUWRI 5160a：5'-TACAGCTCTCGCCTCCGGTT-3'；两者扩增反应条件均为：94℃预变性4 min；然后94℃变性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

3.4水稻材料的RNA提取及cDNA合成
水稻移植于大田后，在水稻幼苗期及穗期对根茎叶部位以及在水稻刚抽穗、灌浆早期、晚期对稻穗进行取样，提取总RNA，DNaseⅠ消化痕量DNA，用氯仿抽提处理后的RNA。在紫外光分光光度计下测其260 nm波长处吸光度A值，确定RNA的浓度，在反转录的过程中进行定量。采用Takara公司的高保真逆转录试剂盒合成cDNA第一链。

3.5水稻SUSIRI基因的表达分析
选取水稻ACTIN基因为内参基因，引物序列为ActinF：5'-GTATCCATGAGACTACATACAACT-3'、ActinR：5'-ACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3'，扩增子长度为270 bp。在目标基因SUSIRI设计1对引物Exon3F：5'-CCTGAATACTGCCCTGT-3'、Exon3R：5'-CTGGATTGGAGGAACTG-3'；扩增序列长度为450 bp。将3.4中的逆转录产物先用ACTIN进行扩增，并以扩增产物的浓度标量cDNA。取等量的逆转录产物即cDNA用引物Exon3F和Exon3R扩增SUSIRI基因片段。RT-PCR反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，50~53退火30 s；72℃延伸20 s，26~30个左右循环，72℃延伸10 min。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物来分析SUSIRI基因的时空表达。

3.6转基因水稻性状的调查
将转基因水稻种子播于含潮霉素(50 mg/L)的琼脂平板上，成苗的单株经PCR检测为阳性的移在盆钵内栽培，15 cm高时移植到大田。生长过程调查分蘖数，成熟时调查株高(至叶片最高处)，收取所有稻穗进行考种，脱粒计数。以挑出所有饱满的谷粒数称取总重量计千粒重并除以总粒数计结实率。

作者贡献
陈坚是本研究的实验设计和实验执行人，完成结果分析及论文写作；连肖华、杨志敏、陈彬及郑斯平分别参与实验设计，试验结果分析与数据调查工作；朱炳耀是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由福建省重点科技项目(2009N1004)和福建省自然科学基金(2011J01104)共同资助；北京大学生命科学学院林忠平教授对本研究给予指导与帮助，前期工作还承蒙福建农林大学吴为人教授的指导。

参考文献
Chen J., Lin Z.P., Duan Y.L., Lan T., and Wu W.R., 2008, Cloning and expression analysis of a SUSIBA2-like gene in rice, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 6(3): 579-582 (陈坚, 林忠平, 段远霖, 兰涛, 吴为人, 2008, 水稻中一个SUSIBA2 相似基因的克隆与表达分析, 分子植物育种, 6(3): 579-582)

Chen J., Lan T., Duan Y.L., Diao Z.J., Tong Z.J., Liang X.H., and Wu W.R., 2009, Establishment of RNAi system against SUSIBA2-like gene in rice, Fujian Nonglin Daxue Xuebao (Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition)), 38(1): 39-43 (陈坚, 兰涛, 段远霖, 刁志娟, 童治军, 连肖华, 吴为人, 2009, 水稻中SUSIBA2相似基因RNA干扰体系的建立, 福建农林大学学报(自然科学版), 38(1): 39-43)

Fang J.H., Zhang M.Z., Liu J., Wang X.Y., and Sun C.X., 2010, Cloning and analysis of SUSIBA2-like gene from Oryza sativa, Henongxue Bao (Journal of Nuclear Agricultural Sci- ences), 24(3): 442-446, 475 (方结红, 张明洲, 刘军, 王雪艳, 孙传信, 2010, 水稻SUSIBA2-like基因的克隆与分析, 核农学报, 24(3): 442-446, 475)

Song Y., Jing S.J., and Yu D.Q., 2009, Research progress on function analysis of rice WRKY genes, Zhongguo Shuidao Kexue (Chinese Journal of Rice Science), 23(5): 447-455 (宋钰, 荆邵娟, 余迪求, 2009, 水稻WRKY转录调控因子基因功能研究进展, 中国水稻科学, 23(5): 447-455)

Sun C.X., H?觟glund A.S., Olsson H., Mangelsen E., and Jansson C., 2005, Antisense oligo-deoxynucleotide inhibition as a potent strategy in plant biology: identification of SUSIBA2 as a transcriptional activator in plant sugar signaling, Plant J., 44(1): 128-138

Sun C.X., Palmqvist S., Olsson H., Borén M., Ahlandsberg S., and Jansson C., 2003, A novel WRKY transcription factor, SUSIBA2, participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the iso1 promoter, Plant Cell, 15(9): 2076-2092

Wu K.L., Guo Z.J., Wang H.H., and Li J., 2005, The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins, DNA Res., 12(1): 9-26

Yu D.Q., Chen C.H., and Chen Z.X., 2001, Evidence for an important role of WRKY DNA binding protein in the regulation of NPR1 gene expression, Plant Cell, 13(7): 1527-1540