擎天凤梨为凤梨科(Bromeliacceae)果子蔓属(Guzmania Ruiz & Pav)植物的总称，其苞片颜色艳丽丰富，观赏期长，兼具室内观赏盆栽和园林地被布置功能，是优良的花卉盆栽植物。果子蔓属也叫擎天凤梨属。擎天凤梨原产于美洲，通过多年的栽培和育种，已经形成大量的观赏品种及变种，但是目前大部分擎天凤梨的品种主要靠引进，需要支付大量的品种使用费。快速获得具有自主知识产权的擎天凤梨新品种具有重要的经济意义。

分子育种可以克服传统育种中远缘杂交不亲和，育种周期长等限制，转基因育种是定向改良植物性状、缩短育种周期的首选策略。通常的植物转基因方法有农杆菌介导和基因枪介导两种，在目前的研究中，农杆菌介导转基因因其不需要特殊仪器、费用低等特点被广泛使用。但是在擎天凤梨中，大量愈伤的获取极其困难、侵染后愈伤死亡率高、愈伤分化慢等原因，造成农杆菌介导转基因的成功率低下、周期冗长。使用基因枪介导的转基因方法相对来说更为直接快速，但也面临转化效率不高、插入基因表达定位不清等问题。因此，如何建立一个高效、操作方便同时能明确表达定位的凤梨遗传转化体系，已成为观赏凤梨分子育种的关键性基础问题。

本研究选取擎天凤梨组培苗茎尖生长组织为材料，以基因枪介导结合GFP荧光蛋白基因，利用GFP的荧光特性分析外源基因的定位表达，建立了擎天凤梨的遗传转化体系。本研究对基因枪介导遗传转化中的主要影响因子进行研究，建立并优化了遗传转化体系，获得了转化再生植株，并利用GFP荧光蛋白基因的荧光特性，分析确定了外源基因的表达定位，为进一步利用分子育种手段培育擎天凤梨新品种打下基础。

1结果与分析
1.1擎天凤梨茎尖组织和小苗对抗生素的敏感性
我们分别选择了茎尖组织、2 cm小苗和4 cm小苗作为抗生素筛选受体。研究发现，茎尖组织由于切口较多，筛选培养基中的抗生素对其的伤害非常大，容易从伤口处褐化最终导致死亡，在潮霉素敏感性试验中，大部分茎尖组织均褐化死亡，少量存活的几个再生苗生长状况也并不好，很难判断是否就是抗性苗，容易形成错判；2 cm小苗和4 cm小苗均是理想的筛选受体，平均而言2 cm小苗比4 cm小苗对抗生素更为敏感，且由于凤梨组培苗生长较慢，要长到4 cm需要较长的周期，因此，后期我们把生长到2 cm的凤梨小苗作为转基因苗筛选工作中的材料。

研究结果表明，擎天凤梨小苗对潮霉素和卡那霉素反应敏感，其存活率分别与潮霉素和卡那霉素抗生素的浓度成逆相关，擎天凤梨2 cm小苗在潮霉素40 mg/L，4 cm小苗在潮霉素50 mg/L时全部死亡，卡那霉素对擎天凤梨2 cm小苗的全部致死浓度则在75 mg/L。王关林和方宏筠认为在选择外植体的抗生素筛选浓度时，不宜选择外植体全部致死浓度，应确定在抑制绝大部分不定芽的分化，杀死非转化细胞，能使转化细胞生存下来的浓度(王关林和方宏筠, 1998, 科学出版社, pp.323-329)。根据这一选择标准和实验结果，我们设定存活率5%~10%的抗生素浓度为筛选浓度，因此得到擎天凤梨2 cm小苗的潮霉素选择浓度为30 mg/L (表1)，4 cm小苗为40 mg/L (表2)；卡那霉素2 cm小苗选择浓度为50 mg/L (表3)。

表1 潮霉素浓度对擎天凤梨2 cm小苗生长的影响 Table 1 Effect of Hygromycin on growth of 2 cm high seedlings of Guzmania Bromeliad in vitro

表2 潮霉素浓度对擎天凤梨4 cm小苗生长的影响 Table 2 Effect of Hygromycin on growth of 4 cm high seedlings of Guzmania Bromeliad in vitro

表3 卡那霉素浓度对擎天凤梨2 cm小苗生长的影响 Table 3 Effect of Kanamycin on growth 2cm high seedlings of Guzmania Bromeliad in vitro

1.2基因枪不同轰击参数下的存活率和抗性芽获得率
基因枪轰击参数与转基因效率直接相关，不同物种相适应的轰击参数也不同，为提高观赏凤梨转基因效率，优化遗传转化体系，我们按不同的金粉直径、氦气压力、射程距离、不同的射击枪数及预培养时间设计试验，设置了16个处理。在进行不同轰击参数下基因枪轰击后，分别统计恢复培养后存活的芽数及筛选培养后获得的抗性芽数。在所有的处理中，最终共筛选获得12个抗性苗。按各个参数加权平均后分别统计存活率和抗性芽获得率，结果表明，金粉直径0.6 μm无论从存活率和抗性芽获得率来说都要优于1.0 μm (表4)；氦气压力则是1 100 psi存活率较高，而1 350 psi抗性芽获得率更高(表5)；射程则是9 cm最佳，6 cm射程只存活了一个芽，且没有抗性芽获得(表6)；从射击枪数看，存活率差异较大，而抗性芽获得率则与枪数成正比(表7)；预培养2天后进行轰击的茎尖组织全部死亡，而直接轰击的存活率在10.87%，抗性芽获得率1.32%。

表4 包埋金粉不同直径对芽再生和获得抗性芽的影响 Table 4 Effect of golden powder diameter on shoots regeneration and rate of antibiotic resistant buds of Guzmania Bromeliad

表5 不同氦气压力对芽再生和获得抗性芽的影响 Table 5 Effect of helium pressure on shoots regeneration and rate of antibiotic resistant buds of Guzmania Bromeliad

表6 不同射程对芽再生和获得抗性芽的影响 Table 6 Effect of field of fire on shoots regeneration and rate of antibiotic resistant buds of Guzmania Bromeliad

表7 不同射击数对芽再生和获得抗性芽的影响 Table 7 Effect of shot amount on shoots regeneration and rate of antibiotic resistant buds of Guzmania Bromeliad

1.3转基因植株的PCR检测
分别以未转基因组培苗(CK)和转基因抗性苗的DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳检测(图1)。检测结果显示，阴性对照凤梨植株1和转基因阴性植株5中均没有观察到相应的条带，株系2、3和4的转基因凤梨植株均观察到大小约为689 bp的目标条带，表明3个转基因株系的基因组中均整合有GFP基因。

图1 GFP基因转基因植株PCR结果分析 Figure 1 Expression analysis of GFP gene in transgenic Guzmania Bromeliad by PCR

1.4 GFP在擎天凤梨植株叶片细胞上的瞬时表达和稳定表达荧光观察
把瞬间转化的凤梨叶片培养24 h后在激光共聚焦显微镜下观察，发现叶片叶肉细胞和表皮细胞均在局部出现大量绿色荧光圆点(图2)。推断这些绿色荧光圆点即为GFP绿色荧光基因在擎天凤梨叶片叶肉细胞和表皮细胞中的瞬时表达。绿色荧光圆点分布于不同的细胞中，疑似细胞核的位置，初步认定pBIN-438-GFP融合蛋白的瞬时表达主要定位于擎天凤梨叶片的细胞核中，在未转化的叶片上则没有看到类似的荧光现象。

图2 pBIN438-GFP融合蛋白在‘太阳神’植株叶肉细胞上的瞬间表达 Figure 2 The transient expression of pBIN438-GFP in Guzmania ‘Focux’ mesophyll cell

分别把PCR检测阳性的转基因凤梨叶片和未转基因的对照植株叶片在激光显微镜下观察，发现除了叶绿素自发红色荧光(图3C1)外，在488 nm激发光下转基因凤梨叶片局部出现大量绿色荧光圆点(图3B1)，应该为GFP基因在转基因凤梨叶片中的表达。绿色荧光圆点存在于不同的细胞中，大小不一，从叶尖到叶鞘，从叶片边缘到中间叶脉位置均有分布，荧光数量呈现不均匀分布；而在未转基因的对照植株叶片中则没有观察到相应的绿色荧光现象，除了叶绿素自发红色荧光(图3C2)外，将荧光背景调整到最亮的情况下，也只观察到叶片表皮中气孔的自发荧光现象(图3B2)。由此我们推断pBIN438-GFP融合蛋白主要定位于凤梨叶片表皮细胞和叶肉细胞的细胞核中，这个结果和我们之前在瞬时表达的凤梨叶片上观察到的是一致的。根据抗性筛选、PCR检测及共聚焦显微镜观察的结果，目前共获得3个转基因株系。

图3 pBIN438-GFP融合蛋白在‘太阳神’植株表皮细胞的细胞核上的表达 Figure 3 The transgenic expression of pBIN438-GFP in Guzmania ‘Focux’ epidermal cell

2讨论
抗生素筛选是遗传转化中的重要阶段，选择适当的筛选受体和选择压是成功的关键因素。不适合的筛选受体会导致漏判和错判，致使后期PCR检验工作量的增大甚至直接导致目标植株的死亡，在前期抗生素敏感性实验中，我们选择了茎尖组织及不同大小的苗作为抗生素筛选受体，发现其对抗生素的敏感性与苗的大小成反比，且越小的苗其时间成本越小。但是直接使用茎尖组织存在错判的问题，茎尖组织切口较多，极容易受到抗生素的伤害，导致其从伤口处褐化并最终死亡，形成错判；而2 cm小苗是较为理想的筛选受体，其植株较为完整，没有直接的伤口，生长周期在合理范围内，对抗生素的敏感程度适当，用其作为筛选材料，可以获得较为稳定可靠的筛选结果。

擎天凤梨的愈伤组织获取较为困难、愈伤分化缓慢且极易死亡，使用农杆菌介导转基因面临着受体难以获得、侵染后愈伤死亡率高、转化时间成本高等问题。基因枪转化法因其不受物种类型的范围限制，靶受体类型广泛，可控度高，重复性好，是除了农杆菌法外应用最广的遗传转化技术，其靶受体几乎包括所有具有潜在分裂能力的细胞或组织，如幼嫩的组织、幼胚、茎尖等。使用茎尖作为靶受体，以基因枪介导的方法相对来说更为直接快速，更适合擎天凤梨的遗传转化。

传统观点认为基因枪转化法易产生多拷贝、导致基因沉默、遗传稳定性差等现象。不过在参考大量基因枪转化的实验报道后我们发现，此观点有失偏僻。在多种作物的基因枪介导的遗传转化研究中，如水稻(Tu et al., 2000; Ye et al., 2001; Datta et al., 2003)、小麦(Stoger et al., 1998)、玉米(郭嘉等, 2012)和马铃薯(Romano et al., 2003)等转基因研究，发现多拷贝转基因植株与单一拷贝的转基因植株在基因表达上效果是相同的，在超过一个拷贝基因的转基因作物中均出现了外源基因高水平表达的现象。在本研究中，通过激光共聚焦显微镜，我们观察到在大部分擎天凤梨转基因植株中，叶肉细胞和表皮细胞中均出现了大量的绿色荧光圆点，表明GFP基因在叶片细胞中得到了较强的表达。也有少量植株中未观察到荧光现象，表现出基因沉默，但是数量仅在10%以下。

基因枪介导法的转化率变化范围较大，在不同的研究报道中，不同物种间呈现数量级的差别，甚至同一受体在不同的研究中也出现了较大的差异，例如在基因枪法转化大豆的首例报道中McCabe等以大豆茎尖为靶受体，转化率达2% (MeCabe et al., 1988)，但在其他的相关报道中转化率远低于这个数；刁现民等(1999)以谷子愈伤组织为靶受体的基因枪法转化率高达4%，但有的报道只有0.03% (Wilkinsa et al., 2000)。影响转化率的因素很多，在基因枪转化法中，不同的轰击参数对转基因芽的存活率和转化率都有直接的影响，本研究中我们通过金粉直径、氦气压力、射程及不同的射击枪数等轰击参数的设置来找出影响其转化率的关键因子。结果表明，金粉直径0.6 μm、氦气压力1 100 psi或1 350 psi均可；射程9 cm、射击枪数3枪 能够获得较好的存活率和最佳的转化率。

观赏凤梨生长周期慢，常规育种时间长，农杆菌介导的遗传转化又面临着愈伤分化难的问题。本研究利用基因枪介导结合GFP绿色荧光蛋白基因，建立了高效的擎天凤梨遗传转化体系，在幼苗甚至刚分化的阶段就可以通过激光共聚焦显微镜进行初步的筛选和验证，减少了工作量，缩短了观赏凤梨遗传转化育种的前期筛选时间。通过激光共聚焦显微镜结合GFP绿色荧光蛋白基因，可以观察到外源基因在转化植株细胞上的定位，为后期其他观赏凤梨的遗传转化和外源基因的定位研究提供一定的基础和依据。

3材料和方法
3.1材料
本实验植物材料为擎天凤梨属太阳神G. ‘Focux’和纯黄星G. ‘Diana’的组培苗茎尖生长组织。质粒pBIN438-GFP由浙江大学生物技术研究所提供。使用基因枪为PDS-1000/He (Bio-Rad)。使用显微镜为德国产Zeiss 510 META型激光扫描共聚焦显微镜。

高渗培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L BA+ 18.2 g/L山梨醇+18.2 g/L甘露醇；增殖和恢复培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L BA；筛选培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.5 mg/L BA+抗生素；壮苗培养基为1/2MS。

PCR检测用的引物为GFP(F)：5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'和GFP(R)：5'-TCACGAACTCCAGCAGGACC-3'。

3.2受体的准备
从擎天凤梨组培苗中剥取大小约0.1~0.2 cm的茎尖生长组织，接种于高渗培养基，培养4~6 h后可进行轰击。

3.3基因枪介导转化擎天凤梨茎尖生长组织
按毛碧增等(2004)及沈晓岚(2010)的方法，使用基因枪对茎尖组织进行轰击。

为优化观赏凤梨遗传转化体系，我们进行了基因枪不同轰击参数的比较实验，分别对金粉直径、氦气压力、射程、不同的枪数及不同的预培养时间进行比较。我们将这五个参数进行设计，共设置了16个处理(表8)，在分别进行不同轰击参数下基因枪轰击后，将转化茎尖组织放置到恢复培养基中进行恢复培养，统计存活的芽数，到小苗长到2 cm左右时放置于筛选培养基中进行筛选培养，分别统计抗性芽获得数，最后按各个参数加权平均后分别计算各参数的存活率和抗性芽获得率。

表8 基因枪不同轰击参数试验设计 Table 8 The experimental design of different parameter by gene gun

3.4转化子的筛选
经轰击的凤梨茎尖组织在增殖培养基上恢复培养，待生长至2 cm大小的苗时转接于含相应浓度抗生素的筛选培养基中筛选抗性转化子，每隔45 d换一次培养基。3~5个月后，将筛选存活的植株转接到壮苗培养基中培养。

3.5转基因植株的PCR检测
以筛选存活的植株叶片DNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增程序为94℃ 5 min；94℃ 30 s，56~58℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。扩增结果用0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检查。目标条带大小为689 bp。

3.6转基因植株的共聚焦显微镜荧光定位观察
剪取PCR检测为阳性的转基因植株的叶片，放置于载玻片上，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片，放置到激光扫描共聚焦显微镜下观察，使用激发光波长488 nm。

3.7 pBIN438-GFP在擎天凤梨叶片表皮细胞上的瞬间表达
按沈晓岚(2010)的方法，用基因枪介导法将质粒导入凤梨叶片后，放入组培室避光培养24~36 h后在共聚焦显微镜下观察。

作者贡献
沈晓岚和毛碧增是本研究的实验设计和实验研究的执行人；沈晓岚及王炜勇完成数据分析，论文初稿的写作；俞少华、田丹青和俞信英参与实验设计，试验结果分析；沈晓岚是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由浙江省重大科技专项重点项目(2009C12095)和浙江省科技厅公益性研究项目(2012C22085)共同资助。

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