黑龙江省大豆生产区近几年各地气温变化是逐年增高，最低增幅为0.16℃/10年，最高增幅为0.73℃/10年。十年九旱，有效积温增加了200℃，季节性的高温干旱天气时常发生，严重的影响了大豆的生长和发育，使大豆产量常因干旱，特别是结荚鼓粒期高温干旱而降低，因此培育抗旱耐逆境胁迫的大豆品种，是实现大豆高产稳产的重要途径。

已有研究表明热休克蛋白的合成与生物体的耐热性是正相关的(Nover et al., 2001; Schöffl et al., 1998; Wu, 1995)。热休克蛋白的合成及积累对植物的应激能力的提高起到重要的作用(Morimoto, 1998; 翁锦周和洪月云, 2006)。人们从热激反应，蛋白质功能，细胞定位和遗传学等诸方面进行了研究(邹杰等, 2007; Li et al., 2005, Cao et al., 2012; Gao et al., 2012; 唐晓飞等, 2009; 陈晓军等, 2006; Zhu et al., 2006)。

然而，这种适应逆境信号的热休克蛋白，还与植物体的抗旱性和耐冷性存在着关系，有研究证实植物的热休克蛋白在防御不同逆境胁迫过程中存在着交叉性。为此，本研究利用基因转移技术，将热激转录因子GmHsFA1基因转入大豆黑农53中，用RtPCR的方法确定各世代转基因植株和GmHsFA1的表达量以及靶基因HSP70等的表达水平；同时利用转热激转录因子GmHsFA1大豆株系，研究了高温和干旱胁迫下，GmHsFA1过量表达株系的靶基因表达，生理生化表现特性，光合特性与产量性状的表现特点，提高大豆抗逆性，为大豆抗逆品种的培育提供技术支持和种质资源。

1结果与分析
1.1 GmHsFA1基因转化大豆
将质粒pBI121-HsFA1用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，回收2.8 kb的质粒，载体质粒PCAMBIA3300用双酶切回收的8.5 kb的质粒，连接酶回收质粒，转化到大肠杆菌中，筛选重组子酶切得到PCAMBIA3300-HsFAI质粒，以草铵膦为筛选标记，以质粒PCAMBIA3300-HsFA1为阳性对照，以黑农53为受体，利用农杆菌介导的方式将HsFA1基因转化到黑农53大豆中，用检测35s-bar的引物进行PCR扩增，得到17株呈现PCR阳性植株(图1)。
 

图1 转基因大豆的PCR检测 Figure 1 Transgenic soybean plants detected by PCR analysis

1.2 GmHsFA1基因在大豆组织中的表达特点
大豆热激转录因子GmHsFA1在叶组织中的表达量较高，转化植株在T₁代测定中，叶组织中的GmHsFA1含量明显高于受体，最高种质材料是受体的5倍以上，当受到高温和干旱胁迫后转GmHsFA1的表达量明显增高，不同株系间差异不同，最高的材料是受体的9倍，而干旱胁迫叶组织中GmHsFA1的表达量增加，表达量最高的材料是受体的6倍以上，但与高温胁迫相比，表达量低于高温胁迫的反应(图2)。
 

图2 高温、干旱胁迫下大豆GmHsFA1基因的表达 Figure 2 The GmHsFA1 expressed in transgenic soybean plants under the treatment of drought and heat stress

1.3与抗高温相关的靶基因在大豆叶组织的表达
热激蛋白HSP70、HSP22与HSP17.9是与抗热性相关的基因，已在许多研究证实，因此在研究GmHsFA1基因大豆对高温和干旱胁迫信号的反应中通过对这些靶基因的表达来证实转基因材料的抗性，通过对不同株系叶组织中HSP70、HSP22和HSP17.9基因测定和分析，我们看到，转基因植株中HSP70、HSP22和HSP17.9基因的表达量明显高于受体黑农53，株系之间有差异。在高温胁迫下，HSP70和HSP22的表达量明显增高，HSP17.9的表达量也增高但不如HSP70和HSP20增幅较大(图3; 图4; 图5)。 而干旱胁迫下，HSP70、HSP22和HSP17.9都有增加，但株系间差异特别大，如HTH-9水分胁迫下，HSP70增加了34倍，而HTH-6株系中HSP17.9增加17倍，HSP22增加34倍。而HTH-13株系干旱胁迫后，靶基因HSP70、HSP22、HSP17.9并没有变化，而对高温的反应变化也不明显，由此也可以看出品种的热激靶基因对不同胁迫的反应是不同的。 
 

图3 高温、干旱胁迫下, 大豆HSF70基因的表达 Figure 3 The HSP70 expressed in transgenic soybean plants under the treatment of drought and heat stress

 

图4 高温、干旱胁迫下, 大豆HSF17.9基因的表达 Figure 4 The HSP17.9 expressed in transgenic soybean plants under the treatment of drought and heat stress

 

图5 高温、干旱胁迫下, 大豆HSF22基因的表达 Figure 5 The HSP22 expressed in transgenic soybean plants under the treatment of drought and heat stress

1.4热激转录因子大豆在高温、干旱条件下的生理变化
大豆热激转录因子GmHsFA1在逆境胁迫下，叶肉组织中脯氨酸含量，丙二醛含量可溶性糖含量明显高于自身CK，但转基因株系间存在差异。高温胁迫下，脯氨酸积累最多的株系是HTH-14，可溶性糖含量增加最多的是HTH-4，而大部分转基因材料丙二醛含量增加的幅度都明显低于受体，只有HTH-14高于受体，表明了转基因材料对高温胁迫是有抵御反应的(脯氨酸, 可溶性糖, 丙二醛) (表1)。
 

表1 大豆热激转录因子GmHsFA1对高温和干旱信号的生理反应 Table 1 Physiological reaction of the heat shock transcription factor GmHsFA1 response to heat and drought signals

干旱胁迫条件下，转基因材料叶组织中脯氨酸积累超过受体的有7个株系，其中HTH-9积累量最高，是受体3倍以上。可溶性糖的含量在干旱胁迫下与自身对照相比都有增加，但与受体相比，多数株系的可溶性糖含量低于受体，有两个株系HTH-6、HTH-5略高于受体，可溶性糖是作物逆境条件下的渗透势调节物质，它反映品种的自我调解能力。而干旱胁迫条件下，转基因大豆叶组织的丙二醛含量低于受体，当干旱胁迫时，各转基因株系的丙二醛含量与自身ck相比都有增加，株系间各异，丙二醛是作物膜损伤的代谢产物，说明干旱条件下，转基因株系的膜损伤比非转基因小。

1.5转基因大豆在高温、干旱条件下叶片光合特性的变化
转GmHsFA1大豆在高温和干旱胁迫下，叶片的净光合速率降低，气孔导度变小，细胞间CO₂浓度减少，叶片的蒸腾速率，瞬时水分利用率降低，株系间有差异。高温条件下光合特性降低幅度较大。但干旱胁迫下，降低幅度较小。转基因株系光和特性降低幅度小于非转基因黑农53的降幅(图6; 图7; 图8; 图9; 图10)。
 

图6 转基因大豆在高温、干旱条件下叶片净光合速率的变化 Figure 6 Effects of heat and drought stress on net photosynthetic rate of transgenic soybean

 

图7 转基因大豆在高温、干旱条件下叶片气孔导度的变化 Figure 7 Effects of heat and drought stress on stomatal conductance of transgenic soybean

 

图8 转基因大豆在高温、干旱条件下叶片细胞间CO2浓度的变化 Figure 8 Effects of heat and drought stress on intercellular CO2 concentration (Ci) of transgenic soybean

 

图9 转基因大豆在高温、干旱条件下叶片蒸腾速率的变化 Figure 9 Effects of heat and drought stress on leaf transpiration rate of transgenic soybean

 

图10 转基因大豆在高温、干旱条件下叶片瞬时水分利用率的变化 Figure 10 Effects of heat and drought stress on efficiency of instantaneous water of transgenic soybean

经过高温、干旱和高温加干旱处理均使GmHsFA1过量表达大豆的产量高于受体，单株荚数小于受体，单株粒数高于受体，单株总重量高于受体(表2)。个别品系与对照相近。
 

表2 高温胁迫下转基因大豆产量降低幅度变化特点 Table 2 Various characters of yield loss of transgenic soybean under the heat stress

1.6大豆热激转录因子GmHsFA1株系的耐热抗旱性的评价
采用胁迫系数与灰色关联分析相结合的方法，对转GmHsFA1基因大豆的耐热性和抗旱性进行综合评价。从表3中可以看出：转基因材料中，有9个材料耐高温能力得到提高，耐热性最强的为HTH- 15；有7个材料抗旱能力得到提高，其耐旱性最强为HTH-5和HTH-9；有5个材料的耐热和抗旱能力都得到了提高。表明热激转录因子GmHsFA1的过量表达能够提高大豆的耐热性和抗干旱能力。
 

表3 大豆热激转录因子GmHsFA1株系的灰色关联度与抗旱耐高温能力的评价排序 Table 3 The evaluation order based on grey correlative degree and ability of heat resistance and high temperature tolerance in transgenic soybean harbored heat shock transcription factor GmHsFA1

2讨论
大豆热激转录因子GmHsFA1的过量表达能够提高大豆对干旱、高温逆境胁迫的抵御能力；转热激转录因子GmHsFA1大豆品系在高温和干旱信号的诱导下，目的基因和靶基因的表达量都明显高于受体；脯氨酸、可溶性糖含量明显增高，光合能力和产量性状表现高于受体植株。通过胁迫系数与灰色关联分析得方法，鉴定评价其耐旱性和耐高温能力明显高于受体。由此证实大豆热激转录因子GmHsFA1的过量表达能够提高大豆的抗旱性和耐高温的能力(吴广锡等, 2012)。

干旱信号对大豆热激蛋白基因诱导和表达在株系中存在差异，从图3到图5中可以看出，干旱胁迫下，转基因大豆中的热激转录因子HSP17.9、HSP22和HSP70基因的表达有的高于受体，有的低于受体。我们认为这些基因是对高温反应敏感的基因，是热激的靶基因，而干旱胁迫对这些基因的表达有影响但并不是干旱的靶基因，可利用这些材料深入研究干旱胁迫下，干旱诱导基因如调节蛋白的转录因子(DREB)、蛋白激酶(MaDK CDPK)和功能蛋白中GST的表达，可进一步解释GmHsFA1的过量表达对调解干旱的作用。

3材料与方法
3.1试验材料
在本研究中所用的大豆转化受体材料为本实验室育成品种黑农53。

3.2载体构建
质粒pBI121-Hsf1 (包含GmHsFA1基因)以及表达载体PCAMBIA3300均由中国科学院遗传与发展研究所朱保葛老师惠赠。

利用LB培养基对PCAMBIA3300和pBI121Hsf1菌落进行培养，设置温度37℃，转速200 rpm/min。用EcoRⅠ和Hind Ⅲ分别对质粒pBI121-Hsf1和载体PCAMBIA3300进行双酶切，回收分别得到包含35s+GmHsFA1+NOS的完整结构约2.8 kb的片段以及约8.5 kb的载体片段。使用T4连接酶将以上两个回收片段进行连接，22℃连接过夜。

将连接产物用热激法转化至大肠杆菌感受态细胞DH5δ中，利用100 mg/L卡那霉素进行重组子的筛选。选取阳性菌落挑出后转化至农杆菌感受态细胞中，在固体YEB培养基中暗培养48 h，至出现大小2 mm左右的菌斑。

3.3遗传转化
采用子叶节的农杆菌介导的遗传转化方法，以草铵膦作为筛选标记，经过预培养，伸长和生根培养获得转化植株。

3.4转基因植株的PCR检测
大豆植株总DNA的提取选用CTAB法，根据bar基因和CaMV35启动子的碱基序列设计并合成引物。PCR扩增产物594 bp。

3.5 T₁-T₉代抗性转基因大豆植株的Rt-PCR检测
将T₁-T₉代转基因大豆植株与受体黑农53分别在常温下种植，分别提取各个大豆叶片的总RNA，并反转录成cDNA，选用的内参为大豆Tubulin基因，以目的基因GmHsFA1和内参Tubulin基因序列各设计并合成引物。引物1 (GmHsFA1基因)：R：5'-TTGCTGTCGTTGCTCCAT-3'；F：5'-ATAACTCGGCGGAAACCT-3'，内参(Tubulin基因)的引物：R：5'-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3'；F：5'-AACCTCCCCTCATCGTACT-3'，并设置看家基因。用MX3000pTM实时荧光定量PCR进行Rt-PCR反应，反应条件为95℃预变性10 min，95℃变性30 s，60℃复性1 min，40个循环，实验重复3次，将含有相对定量结果放置一个坐标图上，数据为3次重复的平均值，绘制扩增曲线，溶解曲线，采用比较G法(△△G)记录相对表达量。

3.6靶基因的检测
以Tubulin为内参分别对靶基因GmHSP70、GmHSP22和GmHSP17.9进行表达量检测，Real-Tme PCR反应在Mx3000pTM实时荧光定量PCR仪上进行。Primer1：检测GmHSP70基因的引物：P1：5'-AACGACCAAGGCAACCGAAC-3'；P2：5'-TCCCTCATCTTGACCAACACC-3'。Primer2：检测GmHSP22基因的引物：P1：5'-CTGGAAGAAACATAGGAGGAGGG-3'；R1：5'-ACTCTGCCTTAACCTTGCCTTCT-3'。Primer3：检测GmHsp17.9基因的引物：P1：5'-TGGATTTCAGAGTGATGGGTTTGG-3'；R1：5'-TCTCTTCGTCCCTCTTTCGTTCCC-3'。

3.7生理指标的测定
脯氨酸测定采用酸性茚三酮显色法，丙二醛和可溶性糖测定均采用TBA显色法(王晶英等, 2003, 东北林业大学出版社, pp.133-136)，光合指标测定采用便携式光合测定仪LI-6400XT (Li-COR Aincoln, OSA)对高温、干旱胁迫后的品系进行光合速率，气孔导度，细胞间CO₂浓度和蒸腾速率进行测定。

3.8产量性状调查
采用常规方法测定单株产量，单株荚数，粒数和百粒重。

3.9品系的抗逆性评价
采用胁迫系数与灰色关联度分析法综合评价各品系之间的抗旱(耐高温)能力。

计算公式：抗逆系数=逆境胁迫下的指标值/正常水分下的指标值

温度处理：CK为常温28℃，高温为48℃。

水分胁迫：CK为土壤水分为18%~20%，干旱处理为土壤水分为8%~9%。

3.10数据分析
灰色关联分析法和差异显著方法分析等数据计算均采用SPSS17.0和DPS7.0分析软件处理。

作者贡献
吴广锡、魏崃和唐晓飞是本研究的实验设计和实验研究的执行人；刘丽君和吴广锡完成数据分析；王伟威、王鹏飞和王兴宇参与实验设计，试验结果分析；刘丽君和吴广锡是项目的构思着和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家转基因重大专项(2013ZX0800- 4002)、现代农业产业技术体系(CAR-04-PS05)和十二五国家科技支撑计划(2011BAD351306-1-4)资助。作者感谢中国科学院遗传与发展研究所朱保葛老师对本实验的帮助。

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